TIPE2 在透明細胞腎細胞癌中的表達和意義

齊建軍，楊麥青，張林，汪釗，王艷峰

（1.昌邑市人民醫院腎內科，山東 昌邑 261300；2.昌邑市人民醫院病理科，山東 昌邑 261300；3.濰坊市人民醫院/濰坊醫學院第一附屬醫院病理科，山東 濰坊 261041；4.北大荒集團總醫院病理科，黑龍江 哈爾濱 150088）

腎細胞癌（renal cell carcinoma）是指腎臟上皮細胞發生的惡性腫瘤，是全世界最常見的腫瘤之一。據報道[1]，2021 年美國有76 080 例新病例和13 780例死亡病例，近幾年腎細胞癌的發病率呈現逐年增加的趨勢。透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常見的腎細胞癌亞型，約占腎細胞癌的70%[2]。目前，手術治療對局限性ccRCC患者是最有效的治療方式[3]。CcRCC 常伴有von Hippel-Lindau（VHL）基因缺失或突變，隨著個體化靶向治療的發展，多靶點酪氨酸激酶抑制劑（TKI）和雷帕霉素哺乳動物靶點（mTOR）抑制劑的應用已成為ccRCC 治療的重大突破[4]。盡管在癌癥研究和藥物研發方面取得了重大進展，但對于復發和轉移的ccRCC 患者目前尚無有效的治療手段，ccRCC 伴有遠處轉移的患者生存率仍然很低[4，5]。因此，尋找該病早期診斷、治療和評估預后的有效分子靶標意義重大。腫瘤壞死因子α 誘導蛋白8（TNFAIP8）樣蛋白家族由4 個成員組成，即結構高度相似的TNFAIP8、TIPE1、TIPE2 和TIPE3。它們在不同的生物學行為中發揮不同的作用，并參與癌癥發生發展的過程[6，7]。TIPE2 位于染色體1q21.2-1q21.3，TIPE2 主要在淋巴組織和骨髓組織中表達[7，8]，參與機體細胞免疫調節。并與炎癥、自身免疫病、腫瘤等疾病的進展密切相關[9，10]。研究表明[11-13]，TIPE2 在結腸癌、肺癌、腎癌組織中呈高表達。另外，在胃癌、肺癌中TIPE2 的表達卻明顯降低[14，15]。本文主要探討TIPE2對ccRCC 增殖和侵襲過程中的作用，分析TIPE2 對Wnt 信號通路關鍵蛋白的影響，以期為ccRCC 的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 數據庫：利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）在線數據庫獲取和分析TIPE2 在ccRCC 和正常腎組織中的表達差異和患者預后評估。細胞：本研究所用ccRCC 細胞786-O 細胞系購自中國科學院上海細胞庫，按照細胞庫官方網站提供的標準培養條件培養。

1.2 方法

1.2.1 TIPE2 的數據庫資料分析 TIPE2 在ccRCC 和正常腎組織中表達情況和臨床病理資料等數據來源于在線數據庫UALCAN。在預后分析中，將獲取樣本分為高表達組（TPM 值高于上四分位數）和低/中表達組（TPM 值低于上四分位數）。具體操作步驟：進入主頁后輸入TNFAIP8，在TCGA datase 對話框內找到透明細胞腎細胞癌；在新打開的頁面點擊expression，然后在對話框內選擇Sample types，將圖保存；在expression 界面再次選擇Nodal Metastasis status，保存圖片；返回上一頁面，點擊survival，圖片保存。

1.2.2 細胞轉染 將786-O 細胞放入六孔板并置于37 ℃含5.0%CO2孵箱培養24 h，使細胞密度達80%～90%。pCMV6-TIPE2 質粒、對照空載體pCMV6質粒、TIPE2 ShRNA 序列和對照shRNA 購自GENECHEM（中國上海）。取2.5 μg 質粒根據Lipofectamine3000（Thermo Fisher Scientific，Inc.）說明書進行轉染。

1.2.3 Western Blot 實驗 收集細胞加入RIPA 裂解液，提取蛋白并測定蛋白含量，取40 μg 蛋白樣品，加入SDS-PAGE 電泳，轉至PVDF 膜后在5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h，加入抗體TIPE2（1:1000，Pro teintech）、GSK3β（1:500，Proteintech）、cyclinD1（1∶500，Proteintech），β-catenin，active-β-catenin，c-Myc 和GAPDH（1∶1000，Proteintech）4 ℃冰箱過夜。第2天，與辣根過氧化物酶結合的小鼠/兔IgG（1:2000，Proteintech）在37 ℃下孵育2 h。最后用ECL（Thermo Fisher Scientific，Inc.）觀察各蛋白條帶，并拍照留存。以GAPDH 作為細胞內蛋白對照，使用Image J1.47 軟件分析各條帶相對蛋白質的表達水平。

1.2.4 集落形成試驗 轉染48 h 后，將細胞消化到6 cm的細胞培養皿（1000 個細胞/皿）中并培養14 d。PBS沖洗3 次，加預冷的甲醇固定15 min，室溫下用蘇木素染液處理10 min，利用成像儀取圖，計數超過50 個細胞的集落（直徑＞0.2 cm），使用GraphPad Prism 6.0 軟件對數據進行統計分析。

1.2.5 細胞增殖試驗 轉染24 h 后，將細胞消化到96孔板（3000 個細胞/孔，100μl 細胞懸浮液）中培養。24 h 后，將20 μl 的CCK-8（Dojindo Molecular Technologies，Inc.）溶液添加到每個孔中，用錫紙包裹，培養2 h。用分光光度法450 nm 測定細胞增殖結果。接下來的4 d 每天都在同一時間進行CCK8加藥處理，在37 ℃恒溫箱中避光孵育2 h，利用GraphPad Prism 6.0 軟件進行數據統計分析，并按時間-吸光度（X-Y）值繪制增殖曲線。

1.2.6 基質凝膠TM侵襲試驗 使用24 孔小室，小室底部有8 μm 孔（Costar，美國）。根據說明，在4 ℃的冰箱中提前融化基質凝膠。以1∶7 的比例混合基質凝膠（1∶7 稀釋，BD Biosciences，美國），放于上室中。轉染24 h 后，將1×105個細胞接種到上室（無血清培養基），并在下室中加600 μl 含有10%胎牛血清的培養基作為引誘劑。20 h 后，在室溫下用甲醇固定小室20 min，蘇木素染色10 min。隨機選擇5 個高倍視野，在顯微鏡下計數侵襲細胞的數量（×20）。

1.3 統計學方法 使用統計學軟件SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0 進行數據分析。計量資料以（）表示，行t檢驗、Kaplan-Meier 進行分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TIPE2 mRNA 和蛋白水平在ccRCC 和正常組織中的表達差異及TIPE2 與ccRCC 預后的關系ccRCC 組織中TIPE2 mRNA 水平和蛋白質表達高于正常腎組織（P＜0.05），見圖1A、圖1B；另外，與無淋巴結轉移（N0）的ccRCC 相比，伴有區域淋巴結轉移（N1）的ccRCC 中TIPE2 的表達升高（P＜0.05），見圖1C。根據在線數據庫UALCAN 的Kaplan-Meier分析，TIPE2 高表達患者總生存期短于低表達患者（P＜0.05），見圖1D。

圖1 TIPE2 在ccRCC 中的表達及其與患者預后的關系

2.2 TIPE2 對ccRCC 細胞增殖和侵襲能力的影響與對照細胞相比，TIPE2 過表達增強了786-OTIPE2 細胞的增殖率和集落形成能力（P＜0.05），見圖2；相反，與對照細胞相比，ShRNA 降低TIPE2 表達并抑制了786-O-TIPE2 的細胞增殖率和細胞集落形成能力（P＜0.05），見圖3；此外，與對照細胞相比，TIPE2 表達增強促進了786-O-TIPE2 細胞的侵襲能力（P＜0.05），相反，TIPE2 表達下調抑制了786-O-ShTIPE2 細胞的侵襲能力（P＜0.05）。

圖2 TIPE2 對ccRCC 細胞增殖和集落形成的影響

圖3 TIPE2 對ccRCC 細胞侵襲的影響

2.3 TIPE2 對Wnt 信號通路active-β-catenin 和靶基因的影響 在786-O 細胞（786-O-TIPE2）中通過TIPE2 基因轉染增強TIPE2 的表達，增加了activeβ-catenin 的表達并抑制Gsk-3β 的表達（P＜0.05）。Wnt 信號通路的靶基因cyclin D1、MMP7 和c-Myc在786-O-TIPE2 細胞中的表達也增加（P＜0.05）。然而，總β-catenin 水平在TIPE2 過度表達后沒有改變（P＞0.05），見圖4A、圖4B；相反，在shRNA 干擾（786-O-ShTIPE2）降低TIPE2 表達后，active-βcatenin、cyclin D1、MMP7 和c-Myc 的表達下降，而Gsk-3β 的表達增加（P＜0.05）；降低TIPE2 后，總βcatenin 水平沒有改變（P＞0.05），見圖4C、圖4D。

圖4 TIPE2 對β-catenin 和Wnt 信號通路的影響

圖4 TIPE2 對β-catenin 和Wnt 信號通路的影響（續）

3 討論

TIPE 家族是一個參與免疫調節和腫瘤發生的蛋白質家族。TIPE 家族蛋白質由一個致死結構域組成，除此之外，與其他家族蛋白質沒有顯著的序列相似性。TIPE2 是該家族的第3 個成員，由184 個氨基酸組成，是先天性免疫和適應性免疫的新型調節因子，參與維持免疫穩態[7-9]。已有研究證實TIPE2 在某些癌癥中出現異常表達，TIPE2 在不同腫瘤中所起的作用不同。TIPE2 可促進多種癌癥的進展，如肺癌、腎細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌[13，17，18]；相反，TIPE2在食管癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌中起到腫瘤抑制作用[19-22]。這些不同的實驗結果說明TIPE2 在不同的癌癥或者癌癥的不同階段起著不同的作用，可能也與實驗者所選取的樣本數量和實驗條件有關?？傊?，TIPE2 在不同癌癥中發揮不同作用的具體機制尚不清楚。

研究發現[13]，TIPE2 的mRNA 表達在腎癌組織中顯著增加，并且與腎癌的TNM 分期呈正相關，這表明TIPE2 高表達與ccRCC 的進展相關。然而，TIPE2 在ccRCC 發生發展中的作用和機制需要進一步研究。本研究通過分析UALCAN 在線數據庫資料，證實TIPE2 在ccRCC 中的mRNA 和蛋白水平的表達高于正常腎組織，在有淋巴結轉移的ccRCC中TIPE2 表達量最高，并且TIPE2 高表達預示ccRCC 患者預后不良。以上結果提示TIPE2 的表達水平可能作為ccRCC 臨床評估預后的指標，TIPE2表達高的患者需要更密切關注疾病發展動態。

已有研究報道[18]，敲除TIPE2 可顯著降低人類肺癌細胞的增殖、遷移能力和存活周期。本研究結果表明，TIPE2 過表達促進了ccRCC 786-O 細胞的增殖、集落形成以及侵襲和遷移能力。目前關于TIPE2在ccRCC 增殖和侵襲機制方面的研究甚少，已有研究表明TIPE2 可以通過調節多種信號通路參與癌癥進展。MicroRNA-21 作為NF-κB 的直接靶點，可參與調節TIPE2 的功能，因此MicroRNA-21 能成為TIPE2 的上游調節因子[23]。在TIPE2 下游影響因素的研究中，有研究發現TIPE2 明顯上調促凋亡蛋白如Bcl-2 相關X、Caspase-9、Caspase-3 的表達，并下調抗凋亡蛋白如Bcl-2 相關X1、Akt 的表達[24]。并且先前研究已經證實TIPE2 可以調節Wnt/βcatenin 途徑的β-catenin、c-Myc 和cyclinD1 的蛋白表達水平并參與疾病的發展[20，21，25]。TIPE2 還能通過調節Akt/mTOR/NF-κB 信號傳導誘導肺癌細胞的增殖和遷移[18]。本研究結果表明，TIPE2 可上調activeβ-catenin 和Wnt 靶基因的表達，如cyclinD1 和c-Myc。沉默TIPE2 后active-β-catenin 和cyclinD1、c-Myc 后表達減少，但TIPE2 只影響active-βcatenin 的表達，未影響total-β-catenin 的表達，說明TIPE2 參與影響β-catenin 的代謝調控而并未影響β-catenin 的轉錄水平。因此，TIPE2 可能通過激活Wnt 信號通路促進ccRCC 的增殖和侵襲能力，這一結果提示TIPE2 參與了ccRCC 的發生發展過程，其有望成為ccRCC 生物靶向治療的候選基因。

綜上所述，TIPE2 在ccRCC 中過度表達，并且與ccRCC 患者的不良預后相關；TIPE2 過表達能夠促進ccRCC 體外增殖和侵襲；TIPE2 是ccRCC 潛在的評估預后的生物學標志物，其可能作為癌基因促進ccRCC 的發展。然而，TIPE2 在ccRCC 中的具體作用機制還有待進一步研究。