頂空固相微萃取結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術解析典型青稞酒中揮發性組分特征

張有香，魯水龍，葉暉春，趙國華，孫海浪，馮聲寶

（青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰?，青?；ブ?810599）

白酒作為一種蒸餾酒，主要成分為酒精和水，約占總量的98 %，決定白酒風格特征的微量組分僅占2 %，但這2 %的風味組分中卻包含了成百上千種揮發性物質[1]。目前在中國白酒、葡萄酒、啤酒及日本清酒揮發性組分研究中均分離鑒定出近1000種揮發性組分，已報道的青稞酒中揮發性化合物種類為112種[2]，遠低于其他酒中的研究結果，與青稞酒復雜釀造工藝特征不相符。為了進一步認識青稞酒揮發性組分及香氣特征，明晰青稞酒獨特風味特征形成的物質基礎，對青稞酒揮發性組分特征的研究手段和技術亟待提高。不僅能夠更全面的解析青稞酒的活性成分,而且通過更深入的解析青稞酒的風格特征,為青稞酒的品質提升、功能價值挖掘、品類打造奠定重要的基礎。

由于白酒中揮發性組分組成的復雜性，目前主要的研究手段是采用傳統氣相色譜(GC)技術對復雜組分進行分離后結合質譜(MS)等檢測技術進行定性、定量分析。傳統一維色譜技術由于峰容量有限，一次僅能分離約100 種揮發性組分，無法滿足白酒中上千種物質的一次性分離分析。全二維氣相色譜技術(GC×GC)是近年開發出的一種多維色譜分離技術[3]，該技術將兩種分離機理不同的毛細管色譜柱通過一個調制器實現串聯結合形成二維氣相色譜系統對樣品進行分析。分析樣品通過第一維色譜柱分離后連續轉移至第二維色譜柱中進行再次分離。與常規一維氣相色譜比較，具有分辨率高,靈敏度高,峰容量大等優點。與高靈敏度的飛行時間質譜(TOFMS)聯合使用,是實現復雜樣品揮發性組分分離鑒定的有力工具。目前GC×GCTOFMS 技術已經被用于多種酒精飲料揮發性組分的分析，是當前分析酒精飲料中揮發性組分最高效的技術手段。本研究采用HS-SPME-GC×GCTOFMS 分析技術用于典型青稞酒中微量特征成分分析，首次對青稞酒中揮發性組分構成進行了全面解析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：本實驗采用的青稞酒樣品為黑老鴉品種秋釀一米查純大曲工藝青稞原酒、瓦藍品種秋釀一米查純大曲工藝青稞原酒、脫皮青稞秋釀一米查純大曲工藝原酒、有機青稞秋釀一米查純大曲工藝原酒，均取自公司原酒庫，存儲時間為5年。

試劑：純氯化鈉，分析純，天津市大茂化學試劑廠；超純水由純水儀(Millipore,Badford,MA,USA)制備。

儀器設備：2 cm 50/30 μm 固相微萃取三相頭（divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)，上海Sigma-Aldrich 貿易有限公司；全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀(GC×GCTOFMS，Pegasus 4D，Leco Corporation,USA)系統，GC×GC 系統由安捷倫7890N 氣相色譜和冷噴調制器KT-2001 組成，本實驗采用液氮冷噴調制器；質譜檢測器為美國LECO Pegasus 4D 飛行時間質譜。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)實驗方法

參照文獻[5]的方法進行。HS-SPME 萃取及進樣過程為手動進行，萃取頭為2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭。萃取溫度50 ℃，樣品平衡時間15 min，萃取時間50 min，恒溫磁力攪拌器轉速400 r/min。

1.2.2 樣品前處理流程

取2 mL 白酒樣品,8 mL 超純水及3.0 g 氯化鈉于20 mL 頂空瓶混合均勻后密封，在50 ℃溫度下樣品平衡15 min，萃取50 min，恒溫磁力攪拌器轉速400 r/min，進行頂空固相微萃?。℉S-SPME）操作，完成萃取后萃取頭于GC 進樣口250 ℃解吸附5 min，進行GC×GC-TOFMS分析。

1.2.3 GC×GC-TOFMS分析方法

色譜柱系統：一維色譜柱DB-FFAP(極性柱，60 m×0.25 mm ID,0.25 μm),二維色譜柱Rxi-17(中等級性柱，1.5 m×0.18 mm ID,0.2 μm)。色譜條件：GC 進樣口溫度250 ℃，進樣模式采用不分流模式進行；第一維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min后，以5 ℃/min 升溫至230 ℃，保持5 min，調制器調制時間為4 s，熱調制時間為1 s，調制補償溫度為20 ℃；第二維柱溫箱升溫程序：起始溫度60 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫至250℃保持5 min，樣品運行采用恒流模式，載氣為高純氦氣(純度99.9995%),流速為1 mL/min。

1.2.4 質譜條件

EI離子源,電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，檢測器電壓為1365 V，采集質量數范圍為35～500 amu，采集頻率為100 spectrum/s。數據采集由LECO 公司Pegasus 4D 工作站控制。

1.2.5 GC×GC-TOFMS數據處理

實驗采集的TOFMS 數據由LECO 公司Chroma TOF 工作站進行數據處理，自動識別信噪比大于50 的色譜峰進行自動積分解卷積和質譜庫比對,質譜庫為NIST 14 和Wiley 9，所有比對結果自動生成“峰表”?！胺灞怼苯涍^進一步人工解譜及同系物二維色譜出峰規律比對驗證后作為初步鑒定結果。剔除烷烴類等沒有風味貢獻的化合物，選擇相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000的化合物作為最終鑒定結果[4]。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS 用于典型青稞酒揮發性組分分離特性分析

白酒作為一種組分十分復雜的體系，傳統一維氣相色譜質譜聯用技術由于分離分析能力的局限無法完成白酒復雜樣品中揮發性組分的有效分離，需要結合繁瑣的樣品預處理、預分離手段。全二維氣相色譜技術的出現為白酒這種復雜樣品的分離提供了新的解決方案[6]。根據全二維氣相色譜分離方式，第一維長色譜柱所有組分經過調制器聚焦后進入第二維短色譜柱進行再次分離，再由高通量的飛行時間質譜進行檢測。色譜柱的選擇上第一維長色譜柱通常采用非極性色譜柱，依靠分離物沸點差異進行分離；第二維短色譜柱通常采用極性柱或中等極性柱，根據化合物的極性差異進行再次分離，最終獲得具有結構特征的二維色譜圖[7]?；谶@一原則，本研究采用一維DB-5MS色譜柱搭配二維Rxi-200 色譜柱對青稞酒中揮發性組分進行分析，獲得圖1 所示全二維分析譜圖。結果顯示青稞酒中揮發性組分十分復雜，一維色譜圖中有大量化合物存在共流出現象，通過進一步的二維色譜分離，共流的化合物在二維色譜圖中得到了較好的分離。

圖1 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS全二維分析圖譜

2.2 青稞酒中揮發性組分的HS-SPME-GC×GCTOFMS分析鑒定

通過全二維氣相色譜分離結合高通量飛行時間質譜檢測,在青稞酒中共分離檢測到1399 個色譜峰。大量色譜峰的檢出，對化合物的鑒定提出了巨大的挑戰，傳統一維氣相色譜質譜峰逐一鑒定方法難以實現。本實驗采用以下策略對譜圖中的化合物進行鑒定分析：通過力可Pegasus 4D 色譜分析工作站結合mainlib 譜庫、replib 譜庫、nist 譜庫以及wiley譜庫的自動解卷積和檢索分析(選擇S/N＞50的色譜峰進行分析)，選擇相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的化合物作為鑒定結果。本研究在典型青稞酒中共鑒定出揮發性組分1399種(表1)。

表1 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的化合物統計(種)

2.2.1 酯類化合物

酯類物質是白酒中種類最豐富的一類揮發性風味組分，本研究鑒定出青稞酒中揮發性酯類物質290種，酯類物質通常具有甜香、花香、果香等香氣特征，表2 列出了重要的70 種酯類物質，包括甲酯類10種，乙酯類35種，丙酯類10種，丁酯類15種，其他酯類7種，乙酯類化合物是青稞酒酯類物質中最重要的一類。

表2 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的重要酯類化合物

2.2.2 醇類化合物

通過力可Pegasus 4D 色譜分析工作站結合mainlib譜庫、replib譜庫、nist譜庫以及wiley譜庫的自動解卷積和檢索分析，選擇相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的醇類化合物，初步鑒定出醇類化合物214種，表3 列出了重要的47種，其中飽和醇24種，不飽和醇17種，其他醇6種，飽和醇類是酒精飲料風味構成的骨架成分之一。

表3 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的重要醇類化合物

2.2.3 酸類化合物

通過力可Pegasus 4D 色譜分析工作站結合mainlib譜庫、replib譜庫、nist譜庫以及wiley譜庫的自動解卷積和檢索分析，選擇相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的酸類化合物，初步鑒定出酸類化合物40種，表4 列出了重要的22種，其中飽和脂肪酸8種，其他酸14種。

表4 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的重要酸類化合物

2.2.4 萜烯類化合物

通過力可Pegasus 4D 色譜分析工作站結合mainlib譜庫、replib譜庫、nist譜庫以及wiley譜庫的自動解卷積和檢索分析(選擇S/N＞50 的色譜峰進行分析)，選擇相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的萜烯類化合物進一步結合人工解譜驗證、二維色譜出峰規律比對驗證和文獻RI的比對驗證，初步鑒定出的萜烯類化合物為91種。表5 列出了重要的萜烯類化合物。對比徐巖等[19]研究中檢測出的萜烯化合物，本研究多出25種。根據文獻報道，本研究檢測出的萜烯類化合物具有愉悅的花香且香氣閾值較低，對青稞酒香氣特征復雜性具有重大的貢獻，其中大部分萜烯類化合物在青稞酒中是首次發現[8-9]，有待后期進一步的研究和分析。

表5 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析鑒定的萜烯類化合物

萜烯類化合物既是構成白酒香氣特征的一類重要香氣化合物，也是白酒中重要的一類生理活性物質。Bata-大馬酮（具有花香、蜜香特征）是清香型白酒中重要香氣化合物，里哪醇、橙花叔醇、β-紫羅酮氧化物都具有愉悅的花香特征，是酒精飲料中的重要香氣化合物[10]。除了香氣貢獻外，萜烯類化合物還有重要的生理功能[11]。α-蒎烯、L-檸檬烯、葑醇等具有抗菌活性，可以抑制多種微生物的生長，如細菌、霉菌；4-萜品醇、龍腦、里哪醇等具有抗病毒活性；薄荷醇具有鎮痛活性；蒎烯類（含檜烯、左旋-α-蒎烯、龍腦）能顯著增加膽汁分泌[12]。青稞酒中檢測出的功能性萜烯類化合物可能對青稞酒的健康價值具有貢獻，但這些物質的含量和功能還需要進一步深入細致的研究。

2.2.5 含氮類化合物

通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析共鑒定出青稞酒中含氮化合物超過111種，包括吡嗪、吡啶、噠嗪、吡唑等，表6 列出了青稞酒中鑒定出的20種重要含氮類化合物，其中有十幾種化合物是首次發現。含氮類化合物一般呈現堅果香、烤面包香及可可的香味，是白酒中重要的一類香氣物質[13-14]。首次發現的含氮類化合物對青稞酒香氣特征和生理功能的貢獻還需要進一步的研究。

表6 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的重要含氮類化合物

2.2.6 含硫化合物

通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析共鑒定出青稞酒中含硫化合物超過48種，表7 列出了青稞酒中鑒定出的13 種重要含硫化合物。硫化物的香氣特殊且香氣閾值較低，對酒的香氣特征具有重要貢獻[15]。揮發性含硫化合物對青稞酒風味貢獻的認知目前還是空白的，文獻報道3,4-二甲基噻吩、2-甲基噻吩具有煮肉的香氣特征[16]，以上化合物對于構成青稞酒香氣的復雜性貢獻值得進一步深入的研究。

表7 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的重要含硫類化合物

2.2.7 酚類化合物

通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析共鑒定出青稞酒中酚類化合物超過68種，表8 列出了青稞酒中鑒定出的重要酚類化合物[17]，比徐巖等[19]對酚類化合物的研究多了18種。

表8 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析鑒定的酚類化合物

2.3 4種不同品種青稞酒之間的比較分析

4 種青稞酒同一米查次同種工藝同一季節揮發性組分之間的比對分析。

本研究采用的樣品為4 種不同品種的青稞酒，分別為黑老鴉青稞秋釀一米查純大曲工藝、瓦藍青稞酒秋釀一米查純大曲工藝、脫皮青稞酒秋釀一米查純大曲工藝、有機青稞酒秋釀一米查純大曲工藝，采用GC×GC-TOFMS 分析方法，從醇、酸、酯、醛酮、呋喃、含硫、含氮、萜烯、酚類9 個層面比較不同品種青稞酒揮發性組分之間的差異[18]，見表9。

表9 4種青稞酒重要揮發性組分種類統計表(種)

2.3.1 酯類化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有210 種、196 種、191種、220種，從圖2 可以看出其中103 種是4 種青稞酒所共有的，黑老鴉青稞酒獨有的有49種，瓦藍青稞酒獨有的有22種，脫皮青稞酒獨有的有23種，有機青稞酒獨有的有28種。

圖2 4種不同原料青稞酒酯類化合物對比圖

2.3.2 醇類化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有119 種、121 種、134種、134種，從圖3 可以看出，其中50 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有32種，瓦藍青稞酒獨有的有29種，脫皮青稞酒獨有的有32種，有機青稞酒獨有的有38種。

圖3 4種不同原料青稞酒醇類化合物對比圖

2.3.3 酸類化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有31種、28種、25 種、36種，從圖4 可以看出其中7 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有12種，瓦藍青稞酒獨有的有6種，脫皮青稞酒獨有的有8種，有機青稞酒獨有的有14種。

圖4 4種不同原料青稞酒酸類化合物對比圖

2.3.4 醛酮類化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有135 種、156 種、145種、152種，從圖5 可以看出其中43 種是4 個品種所 共有，黑老鴉青稞酒獨有的有43種，瓦藍青稞酒獨有的有41種，脫皮青稞酒獨有的有32種，有機青稞酒獨有的有36種。

圖5 4種不同原料青稞酒醛酮類化合物對比圖

2.3.5 呋喃類化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有63種、53種、62種、48種，從圖6 可以看出其中19 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有18種，瓦藍青稞酒獨有的有11種，脫皮青稞酒獨有的有14種，有機青稞酒獨有的有4種。

圖6 4種不同原料青稞酒呋喃類化合物對比圖

2.3.6 含硫化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有31種、17種、20 種、18種，從圖7 可以看出其中4 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有15種，瓦藍青稞酒獨有的有5種，脫皮青稞酒獨有的有4種，有機青稞酒獨有的有2種。

圖7 4種不同原料青稞酒含硫化合物對比圖

2.3.7 含氮化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有24 種、24 種、23 種、18種，從圖8 可以看出其中6 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有7種，瓦藍青稞酒獨有的有7種，脫皮青稞酒獨有的有5種，有機青稞酒獨有的有6種。

圖8 4種不同原料青稞酒含氮化合物對比圖

2.3.8 萜烯化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有37種、45 種、38 種、31種，從圖9 可以看出其中9 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有11種，瓦藍青稞酒獨有的有15種，脫皮青稞酒獨有的有8種，有機青稞酒獨有的有4種。

圖9 4種不同原料青稞酒萜烯化合物對比圖

2.3.9 酚類化合物

從總量上而言，黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、脫皮青稞酒、有機青稞酒分別含有23種、21種、19種、24種，從圖10 可以看出其中9 種是4 個品種所共有，黑老鴉青稞酒獨有的有10種，瓦藍青稞酒獨有的有2種，脫皮青稞酒獨有的有2種，有機青稞酒獨有的有5種。

圖10 4種不同原料青稞酒酚類化合物對比圖

2.3.10 不同原料青稞酒特有化合物統計

本研究采用的樣品分別為黑老鴉青稞酒秋釀一米查純大曲工藝、瓦藍青稞酒秋釀一米查純大曲工藝、脫皮青稞酒秋釀一米查純大曲工藝、有機青稞酒秋釀一米查純大曲工藝，采用GC×GC-TOFMS 分析方法，從醇、酸、酯、醛酮、呋喃、含硫、含氮、萜烯、酚類9 個層面比較不同品種青稞酒揮發性組分之間的差異。表10 列出了4 種不同原料青稞酒所特有的化合物種類數量，依次排序為黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、有機青稞酒、脫皮青稞酒。從表10 中可以看出，黑老鴉青稞酒中除了酸類化合物和萜烯類化合物，其他均高于另外3 種青稞酒，其中特有的含硫化合物可能是形成黑老鴉青稞酒獨特風味的原因之一，黑老鴉青稞酒中含硫化合物的香氣特征有待進一步研究。瓦藍青稞酒中萜烯類化合物的含量均高于其他3 種青稞酒，有可能是形成瓦藍青稞酒獨特風味的原因之一。

表10 4種不同原料青稞酒特有化合物統計表(種)

3 結論

3.1 學習了全二維氣相色譜飛行時間質譜儀原理(GC×GC-TOFMS)，了解了二維和一維之間的不同及二維的優點，白酒作為一種組分十分復雜的體系，傳統一維氣相色譜質譜聯用技術由于分離分析能力的局限無法完成白酒復雜樣品中揮發性組分的有效分離，往往需要結合繁瑣的樣品預處理、預分離手段。全二維氣相色譜技術的出現為白酒這種復雜樣品的分離提供了新的解決方案。根據全二維氣相色譜分離方式，第一維長色譜柱所有組分經過調制器聚焦后進入第二維短色譜柱進行再次分離，再由高通量的飛行時間質譜進行檢測。色譜柱的選擇上第一維長色譜柱通常采用非極性色譜柱，依靠分離物沸點差異進行分離，第二維短色譜柱通常采用極性柱或中等極性柱，根據化合物的極性差異進行再次分離，最終獲得具有結構特征的二維色譜圖?；谶@一原則，本研究采用一維DBFFAP色譜柱搭配二維Rxi-17色譜柱對青稞酒中揮發性組分進行分析，結果顯示青稞酒中揮發性組分十分復雜，一維色譜圖中有大量化合物存在共流出現象。通過進一步的二維色譜分離，共流出的化合物在二維色譜圖中得到了較好的分離。

3.2 首次采用全二維氣相色譜飛行時間質譜(GC×GC-TOFMS)技術對青稞酒揮發性組分特征進行了定性分析，建立了適合于青稞酒揮發性組分分析的GC×GC-TOFMS 方法。將我公司青稞酒揮發性組分的分析能力從百種化合物水平提升至千種化合物水平，初步鑒定出典型青稞酒中揮發性組分1399種，其中酸類物質40 種、酯類290 種、醇類214 種、醛酮類261 種、呋喃及內酯類102 種、硫化物48 種、含氮化合物111 種、酚類68 種、萜烯91 種、其他類129種、未知45種。

3.3 本研究除了檢測出常規的醇、酸、酯等揮發性組分外，還檢測到組分復雜的揮發性含氮、含硫、萜烯類化合物。本研究檢測出的重要含氮化合物有24種，比2014 年解成玉等人對含氮化合物的研究多了22種，這些化合物可能對青稞酒風味具有重要貢獻，同時含硫化合物多了30種，可能對青稞酒香氣特征具有重要貢獻，萜烯類化合物多了25種，這些化合物不僅有一定的香氣貢獻，還具有重要的生理活性。結果證明我公司青稞酒揮發性組分的復雜性和多樣性并不遜于其他白酒。

3.4 首次采用GC×GC-TOFMS 分析方法，從醇、酸、酯、醛酮、呋喃、含硫、含氮、萜烯、酚類9 個層面比較不同品種青稞酒揮發性組分之間的差異，從特有物質種類總量上排序，依次排序為黑老鴉青稞酒、瓦藍青稞酒、有機青稞酒、脫皮青稞酒。黑老鴉青稞酒中除了酸類化合物和萜烯類化合物，其他化合物均高于另外3 種青稞酒，特有的含硫化合物可能是形成黑老鴉青稞酒獨特風味的原因之一，黑老鴉青稞酒中含硫化合物的香氣特征有待進一步研究。瓦藍青稞酒中萜烯類化合物的含量均高于其他3 種青稞酒，有可能是形成瓦藍青稞酒獨特風味的原因之一。脫皮青稞酒和有機青稞酒中含硫、含氮、萜烯、酚類化合物的含量均低于黑老鴉青稞酒和瓦藍青稞酒，脫皮青稞酒中特有的化合物種類最少。