染色質調控因子相關基因在乳癌預后評估中的價值

張蔚然 呂志棟 宋洪明 夏菁 郇喻淇 孔濱

［摘要］ 目的

通過構建染色質調控因子（CRs）相關基因預后模型，探討CRs相關基因在乳癌預后評估中的價值。

方法 在基因表達綜合（GEO）數據庫中進行差異性分析，篩選出CRs相關的差異基因。采用單因素Cox回歸分析和LASSO回歸方法建立CRs相關基因預后模型并進行驗證。選取30對臨床乳癌及癌旁組織樣本，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）方法對關鍵CRs相關基因的表達進行臨床驗證。

結果 依據差異性分析結果建立基于4個CRs相關基因（MORF4L1、NCOA4、TTK和JMJD4）的乳癌病人預后模型，并根據模型風險評分臨界值將病人分為高風險組和低風險組，生存分析顯示高風險組預后較差。RT-qPCR結果顯示，在乳癌組織中MORF4L1、NCOA4的表達下降，TTK、JMJD4的表達升高，與差異性分析的結果相一致。

結論 基于上述4個CRs相關基因的預后模型可以有效預測乳癌病人的預后。

［關鍵詞］ 乳腺腫瘤；染色質調控因子；列線圖；預后

［中圖分類號］ R737.9

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0814-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.179

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231220.2243.003;2023-12-22 10：17：03

VALUE OF CHROMATIN REGULATOR-RELATED GENES IN EVALUATING THE PROGNOSIS OF BREAST CANCER

ZHANG Weiran， L Zhidong， SONG Hongming， XIA Jing， HUAN Yuqi， KONG Bin

（Department of Diagnosis and Treatment Centre of Breast Diseases， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct a prognostic model of chromatin regulator （CR）-related genes， and to investigate the value of CR-related genes in evaluating the prognosis of breast cancer.

MethodsA difference analysis was performed in the Gene Expression Omnibus database to screen for the differentially expressed CR-related genes. Univariate Cox regression analysis and LASSO regression analysis were used to establish and validate the prognostic model based on CR-related genes. A total of 30 pairs of breast cancer tissue samples and adjacent tissue samples were selected， and RT-qPCR was used to verify the expression of key CR-related genes.

ResultsAccording to the results of the difference analysis， a prognostic model of breast cancer patients was established based on four CR-related genes （MORF4L1， NCOA4， TTK， and JMJD4）， and the patients were divided into high- and low-risk groups according to the cut-off value of the risk model. Survival analysis showed that the high-risk group tended to have a poor prognosis. The results of RT-qPCR showed that there were reductions in the expression of MORF4L1 and NCOA4 and increases in the expression of TTK and JMJD4 in breast cancer tissue， which was consistent with the results of the difference analysis.

ConclusionThe prognostic model based on the above four CR-related genes can effectively predict the prognosis of breast cancer patients.

［KEY WORDS］breast neoplasms; chromatin regulators; nomograms; prognosis

表觀遺傳學主要研究那些不是由DNA序列變化引起的可遺傳性狀，表觀遺傳機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA調控等。人類基因組編碼了數以百計的染色質調控因子（CRs），以組織特異性的方式表達，并通過改變表觀遺傳修飾在正常生理和疾病中發揮重要作用。CRs主要包括DNA甲基化劑、組蛋白修飾劑和染色質重塑劑［1］。許多因素如突變等可以導致CRs的功能障礙，并顯著影響各種癌癥的發生和進展［2］。有研究結果表明，CRs相關基因在膀胱癌、低級別膠質瘤等腫瘤預后評估中具有重要價值，并且該研究還建立了有效預后評估模型［3］。根據世界衛生組織的統計數據，乳癌已經成為世界上女性發病率最高的腫瘤［4］。然而，目前的診療方法對基于現有4種乳癌亞型的許多病人的預后評估仍然存在一定局限性［5-6］。CRs相關基因與乳癌預后的相關性的研究報道較少。本研究通過構建CRs相關基因的預后模型，探討CRs相關基因在乳癌預后評估中的價值?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 差異基因篩選

在基因綜合表達（GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的GSE42568數據集以及GSE45255數據集中分別下載基因表達譜和臨床信息進行分析。其中GSE42568數據集包含104例原發乳癌樣本和17例正常乳腺組織樣本，GSE45255數據集包含139例原發乳癌樣本。從既往研究中獲得870個CRs相關基因［7］。這些mRNA表達譜通過對應的R包進行歸一化處理。以|logFC|＞1且錯誤發現率（FDR）＜0.05為標準，應用R軟件的limma包進行差異分析篩選CRs相關差異基因。

1.2 功能分析

采用clusterProfiler軟件包對CRs相關差異基因進行基因本體（GO）功能注釋分析（包括分子功能、生物過程和細胞成分）以及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析。FDR＜0.05和P＜0.05時認為有顯著富集。

1.3 基因預后模型構建和驗證

通過單因素Cox回歸分析篩選出預后價值最高的12個基因，使用glmnet R包，通過LASSO回歸從12個最佳預后基因中篩選出4個關鍵基因構建預后模型。預后預測模塊的工作流程如下：①以GSE42568數據集為訓練集，將其隨機分為內部訓練集和內部測試集，在內部訓練集中采用LASSO回歸方法建立模型；②在內部測試集和外部測試集（GSE45255數據集）中測試模型預測預后的能力；③采用Hmisc R包計算預后模型的一致性指數（c指數）；④循環1 000次，選擇預后模型的條件為內部訓練集、內部測試集和外部測試集的c指數均大于0.7，且內部測試集和外部測試集的c指數平方和最大。風險評分計算公式：風險評分=（Coef1×mRNA1表達）+（Coef2×mRNA2表達）+…+（Coefn×mRNAn表達）。其中Coef為對應的模型系數。根據模型風險評分的臨界值將乳癌病人分為高風險組和低風險組，使用survival R軟件包通過Kaplan-Meier曲線評估乳癌病人的生存期，使用survivalROC R軟件包通過時間相關受試者工作特征（ROC）曲線分析評估模型預測預后能力。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測關鍵基因表達

選取在青島大學附屬醫院接受手術治療乳癌病人的乳癌組織標本30例，以相應癌旁組織作為對照。病人納入標準：①原發性女性乳癌病人；②臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他原發腫瘤或有其他原發腫瘤病史病人；②病理資料不全病人。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會審批，所有病人均對研究知情同意。

使用TRIzol試劑（Takara，Kusatsu，Japan）提取組織標本總RNA，用反轉錄試劑盒（Vazyme，南京，中國）合成cDNA。目標序列用SYBR-Green試劑（Vazyme，南京，中國）進行擴增。采用2ΔΔCt方法計算各基因在乳癌及癌旁組織中的相對定量表達。RT-qPCR引物及其序列見表1。

1.5 模型預后預測能力評估

采用臨床相關性分析，評估模型風險評分與年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（Her2）、腫瘤分級、T分期、淋巴結狀態等臨床因素的相關性。采用單因素和多因素Cox回歸分析評估年齡、ER、PR、Her2、腫瘤分級、T分期、淋巴結狀態、模型風險評分是否為乳癌的獨立預后因素。

1.6 列線圖構建及驗證

根據單因素和多因素Cox回歸分析結果，基于乳癌獨立預后因素相關指標建立列線圖，用以評估乳癌病人3年和5年的生存率。通過c指數和校正曲線驗證列線圖預測預后的準確性和實用性。

1.7 統計學分析

采用R軟件（版本4.1.3）進行統計學分析，兩組計量資料比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 CRs相關差異基因的篩選

從既往文獻中獲得了870個CRs相關基因，在GSE42568和GSE45255數據集中取交集，得到707個共同基因。對GSE42568數據集中全部104例乳癌組織標本和17例正常乳腺組織標本進行共同基因的差異性分析，共篩選出168個CRs相關差異基因，其中上調基因136個，下調基因32個（圖1）。

2.2 功能分析

采用GO和KEGG富集分析，探討168個CRs相關差異基因的潛在生物學功能及信號通路。GO分析結果顯示：在生物過程水平，差異基因在組蛋白修飾、肽基賴氨酸修飾、染色質組織、組蛋白甲基化和組蛋白賴氨酸甲基化方面顯著富集；在分子功能水平，差異基因在轉錄共調節因子活性、組蛋白結合、轉錄共抑制因子活性、組蛋白甲基轉移酶活性和轉錄共激活因子活性中顯著富集；在細胞成分水平，差異基因在甲基轉移酶復合體、組蛋白甲基轉移酶復合體、組蛋白去乙?；笍秃象w、PcG蛋白復合體和異染色質中顯著富集。這些結果表明，差異基因的功能主要富集于組蛋白修飾相關功能。KEGG通路分析結果表明，差異基因主要參與賴氨酸降解、Notch信號通路、細胞周期、病毒生命周期-HIV-1、胰高血糖素信號通路、甲狀腺激素信號通路、癌癥中的轉錄失調以及病毒致癌相關通路（圖2）。

2.3 構建CRs相關基因預后模型并驗證其效力

采用單因素Cox回歸分析CRs相關差異基因的預后價值，以P＜0.005為標準，共獲得12個最佳預后基因（圖3A）。再使用LASSO回歸分析成功構建了包含4個基因（MORF4L1、NCOA4、TTK和JMJD4）的預后模型。風險評分=（-0.556 4×MORF4L1表達）+（-0.088 5×NCOA4表達）+（0.048 4×TTK表達）+（0.279 8×JMJD4表達）。低、高風險組風險評分的最佳臨界值為0.156。生存分析顯示，高風險組病人的預后明顯較差（圖3B、C），提示風險評分與預后呈負相關。時間依賴的ROC曲線分析顯示，在GSE42568數據集中模型預測乳癌病人1、3、5年生存率的ROC曲線曲線下面積（AUC）分別為0.794、0.784和0.837（圖3D），表明模型具有良好的預測預后能力。在GSE45255數據集中使用相同的方法進行驗證，所得的結果與GSE42568數據集結果相一致，時間依賴性ROC曲線分析顯示，模型預測病人1、3、5年生存率的AUC分別為0.780、0.716和0.730，證實模型具有良好的預后預測能力。

2.4 乳癌組織中關鍵基因表達的驗證

RT-qPCR檢測結果顯示，與癌旁組織相比，乳癌組織中MORF4L1和NCOA4的表達顯著降低，TTK和JMJD4的表達顯著增高，與差異性分析結果相一致（圖4）。

2.5 風險評分和臨床參數相關性分析

箱線圖分析結果顯示，不同腫瘤分級、T分期、淋巴結狀態和乳癌分子亞型病人風險評分比較差異具有統計學意義（圖5），其中G3、T2-3以及三陰性乳癌病人的風險評分較高（P＜0.05）。但年齡＞60歲及≤60歲乳癌病人的風險評分差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 模型預后預測能力評估

單因素Cox回歸分析顯示，風險評分、ER、PR、Her2和淋巴結狀態與乳癌病人的生存期相關（圖6A）。多因素Cox回歸分析顯示，風險評分和淋巴結狀態是乳癌病人的獨立預后因素（圖6B），表明該預后模型具有良好的預后預測能力。

2.7 列線圖構建及驗證

根據Cox回歸分析結果，構建一個包含淋巴結狀態和風險評分的列線圖，以圖形化的方式評估乳癌病人3、5年的生存概率（圖7A）。該列線圖的c指數為0.826 5，3年和5年校正曲線表明該列線圖預測結果與實際觀察結果之間具有良好的一致性（圖7B、C）。

3 討? 論

乳癌作為女性最常見的癌癥，具有較高的發病率、復發率與死亡率［8-9］?；贓R、PR以及Her2的乳癌分子分型對治療指導以及預后評估具有較高的準確性，但該分型仍然存在不足［10］。CRs相關基因的異常表達參與了許多乳癌相關生物學過程，但其在乳癌中的預后價值尚有待研究。

本研究首先通過GSE42568數據集篩選了168個在乳癌與正常乳腺組織中差異表達的基因，并對差異基因進行富集分析。GO分析結果顯示，差異基因的功能主要富集于組蛋白修飾。既往有文獻報道，異常的組蛋白乙?；揎椗c乳癌的DNA修復、凋亡、代謝、轉移等相關基因的表達有關［11］；組蛋白修飾劑被認為是有前途的治療靶點，組蛋白修飾抑制劑西達苯胺聯合酪氨酸激酶抑制劑和免疫檢查點抑制劑可以重塑乳癌腫瘤免疫微環境，提高藥物的抗腫瘤活性［12］。KEGG富集分析結果表明，CRs相關差異基因主要富集于與組蛋白翻譯后修飾相關的信號通路，參與調節細胞周期中染色質結構以及基因轉錄過程［13-14］。

本研究進一步構建了基于4個CRs相關基因（MORF4L1、NCOA4、TTK和JMJD4）的預后模型，根據模型風險評分臨界值將病人分為高、低風險組，并全面分析模型預后預測能力。分析預測模型與臨床參數的關系結果顯示，腫瘤分期高、存在淋巴結轉移的病人風險評分較高，Luminal亞型、Her2過表達亞型和三陰性亞型風險評分依次升高。既往有臨床研究顯示，Luminal亞型乳癌腫瘤級別低，病人生存率高，預后最佳，而三陰性乳癌具有增殖率高、侵襲性高、早期復發的特點［15-16］。上述結果表明，較高的風險評分提示乳癌較差的預后。本研究單因素、多因素Cox回歸分析顯示，風險評分和淋巴結狀態是乳癌的獨立預后因素，進一步證實了該模型的臨床應用價值和預后預測能力。

本研究篩選了4個基因構建預后模型。差異分析顯示，MORF4L1和NCOA4在乳癌組織中的表達顯著降低，TTK和JMJD4在乳癌組織中的表達顯著增高。進一步通過臨床樣本驗證4個基因在乳癌組織中的表達水平，所得結果與差異分析結果相一致。既往研究表示，MORF4L1是NuA4組蛋白乙酰轉移酶復合體的一部分，作用于DNA雙鏈斷裂修復過程，在乳癌起始和進展中起保護作用［17-19］。NCOA4在乳癌免疫喚醒中具有重要作用，其低表達提示膽管癌、結腸腺癌和腎透明細胞癌預后較差［20-22］。TTK是一種能夠磷酸化蘇氨酸/絲氨酸和酪氨酸的雙特異性蛋白激酶，在乳癌組織中表達水平較高，其過表達與乳癌腫瘤大小、TNM分期和Ki-67指數呈正相關，提示預后不良［23-25］。JMJD4是一種C4賴氨酸羥化酶，被認為在轉錄終止、胚胎干細胞維持和胚胎發育中發揮廣泛的作用，其高表達是透明細胞腎細胞癌及結腸癌病人的獨立預后因素［26-29］。上述結果表明，這4個關鍵基因可能成為乳癌診斷的生物學標志物。

總之，本研究構建了一個基于4個CRs相關基因的預后模型，經驗證該模型可以有效評估乳癌病人的生存預后。

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（本文編輯 馬偉平）