中性粒細胞在潰瘍性結腸炎中的作用機制及臨床應用研究進展

鄭文濤 康錦鈺 周穎 張謝 宋毓飛

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一類主要累及結直腸，腸道黏膜病變呈彌漫連續性，病程以復發和緩解交替為特征的慢性炎癥性疾病。進入21 世紀，UC 已經發展為全球性疾病，患病率逐年升高，給社會造成巨大的經濟負擔，是現代醫療衛生系統的一大挑戰[1]。為了改善疾病的自然病程并盡可能保留腸道功能、改善預后，對UC 治療目標的選擇也從臨床緩解轉為內鏡緩解[2]。但仍有相當部分實現內鏡緩解的患者結腸組織中存在組織學活動的表現，進一步追求組織學緩解有利于改善患者的長期預后[2-4]。中性粒細胞（neutrophils，NEU）浸潤是UC 的重要組織學微觀特征，實現黏膜無NEU 浸潤與疾病復發率降低相關[5]。NEU 在UC 發生、發展中起關鍵作用，其在內鏡活檢下的組織病理活動狀態以及NEU 相關生物標志物在UC 的診斷、評估疾病活動性、預測臨床預后中有重要參考價值。本文就NEU 在UC 發病中的作用機制及其臨床應用的研究進展作一綜述。

1 NEU 在UC 發病機制中的作用

NEU 在機體固有免疫功能中發揮重要作用，但其功能的“過度激活”可誘發多種自身免疫性疾病[6-7]。NEU成熟的過程中會有3種不同類型的蛋白顆粒形成：原發性顆粒，包括髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）等；繼發性顆粒，包括膠原酶等；三級顆粒，包括基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等[6]。UC中有大量的NEU浸潤腸道黏膜，釋放蛋白顆粒及活性氧等成分損傷細胞和組織，導致典型的UC黏膜表現如隱窩炎、黏膜糜爛、潰瘍形成[8-9]。

1.1 NEU 釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重腸道炎癥 ROS 包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫等，它們能夠通過對DNA、蛋白質、脂質等各種細胞成分的氧化作用來誘導細胞的死亡，造成組織損傷和炎癥反應[10]。NEU 在吞噬細菌、顆粒狀物質和可溶性刺激物時可產生大量的ROS[9]。腸道黏膜中浸潤的NEU 過度分泌的ROS 和機體對ROS 清除能力的不足會導致ROS 在腸道黏膜中的累積[11-12]。ROS可以促發氧化應激反應和激活蛋白水解酶，引起腸道黏膜上皮細胞滲透性升高和腸腔內病原體入侵腸道固有層，加重黏膜炎癥和炎癥損傷，導致UC 發展過程中的腸黏膜細胞壞死和潰瘍形成[9]。

1.2 中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）加重黏膜炎癥并促進血栓形成 NETs 是NEU 膜上外突的網狀結構，包括解濃縮的染色質、DNA 和抗菌肽，在NEU 抗微生物功能中發揮重要作用[13-14]。NETs 在UC 患者中的表達水平高于健康人群，這提示兩者之間存在著潛在的病理聯系[15]。NEU 能夠被多種因素刺激產生過度表達的NETs，如炎癥細胞因子、一氧化氮、各種自身抗體以及NEU 和血小板的相互作用等[13]。過表達的NETs 能夠分泌IL-1β、TNF-α等，放大炎癥級聯反應，是UC 患者腸道黏膜免疫炎癥反應失調的重要促發因素[13]。Angelidou 等[16]的研究表明REDD1/autophagy/NETs/IL-1β 信號轉導通路的激活，產生的IL-1β 參與介導UC 的腸道炎癥和黏膜損傷。此外，UC 是深靜脈血栓和肺栓塞事件已知的危險因素[17]。UC 患者的結腸組織及外周血中存在的NETs是活化組織因子（tissue factor，TF）的主要來源[16]?；罨疶F 的分泌主要由炎癥微環境來調控，并在UC 相關的血栓形成（如腸多灶性梗死）過程中起重要作用[16]。

1.3 NE 加重組織損傷并影響生物制劑療效 NE 是一種絲氨酸蛋白酶，發現于NEU 的原始顆粒[18]。UC 患者腸道黏膜組織中的NE 在mRNA 和蛋白水平上的表達均高于健康人群[18]。NEU 能釋放大量的NE、蛋白酶-3 和組織蛋白酶G，其中NE 能夠水解細胞外基質的重要成分——彈性蛋白[19]。這些NEU 顆粒蛋白酶能夠殺傷被吞噬的病原體，但其過量釋放會導致組織的損傷，并抑制慢性炎癥性疾病中機體對凋亡細胞的清除[19]。腸道蛋白酶和抗蛋白酶平衡的失調是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的重要發病機制。研究表明UC患者腸道黏膜中的NE和彈性蛋白酶抑制物Elafin 均表達增高[19]。但表達增高的Elafin 仍不足以彌補大量釋放的NE導致的彈性蛋白過度水解[19]。絲氨酸蛋白酶抑制劑B1，是最有效的內源性NE 抑制物之一，能夠抑制由H2O2誘導的胞內NE 活性表達[20]。絲氨酸蛋白酶抑制劑B1 的相關作用也被認為是UC 疾病中腸上皮細胞保護的重要機制之一[20]。英夫利昔單抗（TNF-α 單克隆抗體）是用于治療UC 的第一種生物制劑，主要用于治療中重度UC，已被證明能夠顯著改善患者的臨床癥狀和誘導黏膜愈合[21]。NE 對英夫利昔單抗的水解作用，破壞了英夫利昔單抗中和TNF 的能力。這也能解釋臨床上部分患者對英夫利昔單抗治療表現為無反應或反應微弱，達不到目標療效[19]。

1.4 MMPs 損傷腸道黏膜屏障 MMPs 是一類結構相似的鋅依賴蛋白酶，參與細胞外基質的降解和重塑，其表達水平的增加與免疫介導的組織損傷相關[22-23]。在UC發病機制中，MMPs 通過損傷基底膜，改變腸道屏障的通透性，激活和招募促炎細胞因子，抑制上皮細胞再生，調節血管生成等途徑發揮關鍵作用[22，24]。MMP-9是參與UC發生、發展的主要MMPs[23]，隨著NEU大量浸潤腸道黏膜，MMP-9 由NEU 脫顆粒釋放向炎癥微環境[22，25-26]。MMP-9 可破壞腸道黏膜細胞間緊密連接，使得腸道黏膜通透性增高，加重黏膜屏障功能的損害[27]。

1.5 細胞因子與NEU 相互作用促發UC 炎癥活動NEU 在活動性UC 的固有層免疫細胞中占據優勢地位，常常是造成黏膜損傷的主要效應細胞[28]。NEU 和細胞因子相互作用在UC 發病機制中有重要作用。在UC 中，IL-1β 主要由存在于血液循環以及炎癥腸道局部的NEU等免疫細胞產生，導致組織損傷及炎癥。IL-1β的產生途徑主要有中性粒細胞絲氨酸蛋白酶途徑和炎癥小體依賴的半胱天冬酶-1 途徑[28]。因此，阻斷中性粒細胞絲氨酸蛋白酶和半胱天冬酶-1可能是未來治療UC 的一項治療策略[28]。Stakenborg 等[29]研究發現NEU通過“肝細胞生長因子-肝細胞生長因子受體酪氨酸激酶”信號轉導通路表達促炎細胞因子IL-1β 和TNF-α，促進幼稚T 淋巴細胞向Th17分化，誘導腸道黏膜的炎癥反應?？乖禺愋灾行粤＜毎诖侔lUC炎癥活動中有重要作用：NEU暴露在抗原環境中，隨后特異性抗原與致敏的NEU 表面形成的“Fcγ 受體Ⅰ/特異性免疫球蛋白G復合體”結合，刺激NEU釋放TNF-α等促炎細胞因子，從而引起UC的炎癥活動和病情復發[30]。

1.6 NEU 在UC 中的保護性作用 目前認為NEU 在腸道損傷修復中具有促炎癥和保護性雙重作用[31]。NEU通過吞噬作用、釋放NETs、抗菌肽、ROS 等抵御入侵受損腸道的微生物；同時可通過釋放促修復因子、趨化因子、生長因子等促進腸道屏障的恢復，有助于黏膜愈合[31]。也有研究發現部分NEU 群體在UC 中發揮著保護性作用。CD177+NEU 亞群被發現能夠比CD177-NEU 釋放更高水平的ROS 和抗菌肽來提高腸道防御能力，而表達較低水平的促炎細胞因子[32]。同時CD177+NEU 高表達IL-22 有助于維護腸道上皮的完整性[32]。Leppkes 等[33]發現在UC 糜爛出血病灶處，浸潤的NEU 通過肽?；彼崦搧啺访?（peptidylarginine deiminase type 4，PAD4）介導形成的NETs 重塑血液凝塊為免疫血栓，這些免疫血栓的形成有助于減少腸道出血，促進傷口愈合。

2 NEU在UC中的臨床應用

2.1 NEU 在預測UC 臨床預后中的應用 臨床上廣泛將臨床緩解和內鏡緩解作為UC 患者的治療目標，以改善患者的臨床預后[34]。但越來越多的研究表明組織病理學層面的緩解更能代表UC 患者的良好預后，讓患者獲得更長的臨床緩解期，減少疾病的復發率和加重率[3，34-36]。將組織學緩解作為評估病情的優選指標能更有效地反應疾病活動性、治療應答，預測臨床預后[5]。UC 的組織學特征包括結腸基底漿細胞增多、NEU 浸潤、嗜酸性粒細胞增多、黏蛋白耗竭以及隱窩結構異常，其中NEU 浸潤是影響UC 臨床復發最重要的危險因素[4]。此外，上皮層NEU 浸潤的改善往往是治療應答上最先出現的指標變化，對于預測1 年后的內鏡緩解和內鏡下黏膜組織學緩解的準確度最高[37]。建議在臨床治療實踐中，將上皮層NEU 浸潤的改善作為治療目標之一[38]。

上皮層或固有層NEU 浸潤是公認的UC 疾病活動的標志[36，39]。相關研究常常將NEU 相關指標作為組織學緩解定義標準的重要部分，如上皮層缺乏NEU，固有層缺乏NEU，無隱窩膿腫。上皮層缺乏NEU 浸潤和無隱窩膿腫與改善的臨床預后相關，包括更低的復發率和更小的結直腸病變累及范圍[3]。相對于發現組織中NEU 活動的患者，未發現NEU 活動患者的復發相對風險降低了60%～70%[36]。在一項前瞻性研究隊列中，以NEU 相關炎癥為特征的組織學活動是患者3 年隨訪期內需要使用皮質類固醇激素來控制癥狀的唯一獨立預測因素[35]。該前瞻性隊列研究表明達到NEU 相關的完全組織學緩解對UC的良好預后具有重要價值[35]。

2.2 NEU 相關標志物在UC 的臨床預后、活動性評估中的應用

2.2.1 糞便標志物 鈣衛蛋白，主要來源于NEU，富含于NEU 胞質[40]。鑒于內鏡檢查給患者帶來的不適感和并發癥風險，糞便鈣衛蛋白（fecal calprotectin，FC）作為一個非侵入性的IBD 腸道黏膜炎癥標志物，有助于評估疾病活動性、黏膜愈合情況、疾病復發風險[40]。Magro 等[39]研究表明基于FC 的檢測能夠反映UC 患者是否處于組織學緩解狀態，從而減少一部分患者對于內鏡檢查的需求。對于無癥狀UC 患者，FC 和糞便中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白也能夠有效評估患者的疾病活動性[41]。而在低級別腸道炎癥狀態下，糞便中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白在監測疾病活動性上可能比FC 更具備潛在優勢[42]。

2.2.2 血清標志物 考慮到糞便樣本獲取及加工處理的不便性，中性粒細胞淋巴細胞比值通過簡單的血常規細胞計數的運算即可獲得。其能夠反映UC 疾病活動性，并且能夠作為患者接受抗TNF 藥物治療后達到臨床緩解和黏膜愈合的早期預測因子[43]。此外，de Bruyn 等[44]研究發現血清NEU 相關標志物（NEU 計數、殼多糖酶3 樣蛋白1、LL-37）聯合CRP 能夠準確監測UC 患者接受抗TNF 藥物治療后的黏膜愈合情況。CPa9-HNE，是Mortensen 等[45]新發現的經NE 降解后的血清鈣衛蛋白新抗原表位片段，研究表明其能夠準確監測IBD NEU 活性和疾病活動性，且有望成為能夠預測IBD 患者達到黏膜愈合的潛在生物標志物。

2.3 NEU 作為UC 的治療靶點

2.3.1 抑制NEU 釋放ROS 橙皮苷甲基查爾酮（hesperidin methyl chalcone，HMC）是一種柑橘生物類黃酮，具有抗炎、鎮痛、抗氧化的特性，能夠通過增加結腸的抗氧化能力和谷胱甘肽水平來降低氧化應激的發生，減少腸道黏膜NEU 的浸潤以及黏膜炎癥損傷[11]。橙花叔醇（nerolidol，NRD），一種天然存在的具有膳食生物活性的脂肪族倍半萜醇[46]。MPO 主要存在于NEU的原發性顆粒中，常常作為衡量NEU 浸潤程度的指標之一[46]。NRD 處理能夠顯著降低MPO 活性，減少NEU浸潤，抑制促炎細胞因子的分泌，緩解UC 的結腸炎癥[46]。NRD 還可通過上調組織中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平來減少ROS 和脂質過氧化物的生成，同時上調體內重要的還原劑谷胱甘肽的含量[46]。環孢素A（cyclosporine A，CsA）是鈣調神經磷酸酶抑制劑之一，作為臨床上治療嚴重難治性UC 的誘導劑使用。研究發現CsA 可以通過“沉默信息調節因子6/缺氧誘導因子-1α”依賴的糖酵解途徑來抑制NEU 釋放ROS、MPO 和抗菌肽，從而抑制NEU 的遷移能力和凋亡，防止腸道黏膜中招募的NEU 的過度激活和炎癥暴發[47]。

2.3.2 抑制NETs 的形成及NE 活性 染色體外DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）參與NETs 的形成，而DNA 酶能夠有效地水解炎癥結腸局部的結腸細胞向細胞微環境釋放的ecDNA[48]。因此調節ecDNA 通路相關的治療策略或許會是一個潛在的治療UC 的方向，包括對DNA 酶的應用[48]。葡萄球菌核酸酶（staphylococcal nuclease，SNase）是一種非特異性的磷酸二酯酶，具有很強的降解DNA 的能力[49]。研究人員利用交聯技術制備了海藻酸鈣包裹的SNase——ALG-SNase凝膠微球，凝膠微球可將SNase 成功輸送到結腸，隨后觀察到NETs 被降解，減輕了結腸組織的炎癥狀態[49]。同時腸道通透性降低，保護了腸道屏障功能，這與閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1 的表達上調有關[49]。PAD4對組蛋白瓜氨酸化的催化活性在NETs 的形成過程中起著關鍵作用[50]。阻斷這種翻譯后的蛋白修飾過程已被證明可以有效治療UC，如PAD4 抑制劑的使用[48，50]。NE 的蛋白水解特性，破壞了英夫利昔單抗對TNF 的中和作用，降低了英夫利昔單抗的臨床應答率。通過添加外源性蛋白酶抑制劑來抑制NE 活性是UC 一種潛在的有效治療策略，聯合外源性蛋白酶抑制劑和生物抗體制劑療法可以起到相輔相成的效果[19]。

2.3.3 抑制MMP-9 的表達 MMP-9 被認為是治療UC的新靶點，MMP-9 的表達隨著UC 的病情進展而升高，但在UC 得到有效治療后表達下降[51]。Andecaliximab（GS-5745）是一種完全人源化的高親和力IgG4 單克隆抗體，能夠選擇性結合并抑制MMP-9[24]。一項Ⅰ期隨機安慰劑對照臨床試驗表明，Andecaliximab 處理能夠通過降低MMP-9 的基因表達和組織表達水平來改善UC 患者的臨床、內鏡和組織病理預后[24]。但另一項隨機雙盲安慰劑對照的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗卻發現Andecaliximab 處理組與安慰劑組相比，在臨床緩解應答率、內鏡緩解應答率和黏膜愈合率上差異均無統計學意義。這可能與Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗的安慰劑組緩解率相對Ⅰ期試驗更高，以及Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗相較Ⅰ期試驗包含更多的難治患者有關[22]。而de Bruyn 等[52]的研究表明MMP-9 的藥理抑制并未改善IBD 的結腸炎癥，認為MMP-9 表達的上調是腸道炎癥的結果而非炎癥的致病病因?？梢娪嘘PMMP-9 的藥理抑制在UC 治療中的作用仍有爭論，需要更深入的研究加以驗證。

2.3.4 抑制NEU 釋放促炎細胞因子 熊果酸（ursolic acid，UA）是一種從薰衣草、蘋果皮等藥用植物及水果中提取純化而來的天然五環三萜羧酸[53]。UA處理能夠減輕UC黏膜上皮內NEU炎性浸潤，同時能夠下調血清和結腸組織中IL-6 水平[53]。SM934 是一種新型的水溶性青蒿素類似物，據報道其在免疫抑制方面表現出良好的潛力[54]。SM934 處理后MPO 活性顯著降低，同時結腸組織中浸潤的巨噬細胞和NEU 數量顯著減少，引起促炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表達的減少，減輕UC 的腸道炎癥損傷[54]。肽聚糖識別蛋白1（peptidoglycan recognition protein 1，PGLYRP-1）與髓樣細胞觸發受體1（triggering receptor expressed on myeloid cells 1，TREM-1）相結合能夠刺激NEU釋放TNF-α、IL-β、IL-6和MPO，而抗TREM-1 抗體能夠阻斷這些促炎癥因子釋放的過程[55]。這個抑制效應被證實在NEU 高度浸潤和PGLYRP-1高表達的UC患者人群中表現更顯著[55]。

3 小結和展望

NEU 在UC 中的病理作用主要與ROS、NETs、NE、MMPs 以及一些促炎細胞因子的釋放有關。它們造成腸道組織黏膜的損傷，促發并加重腸道黏膜炎癥，形成糜爛、潰瘍和出血。以這些蛋白酶和細胞因子為靶點的治療效應在一些動物和臨床研究中得到了初步驗證。但目前以NEU作為藥理靶點的治療策略尚缺乏高質量的臨床研究來證實其在UC中的療效和安全性。

NEU 在UC 發病中同時起著促進炎癥發展和腸道保護作用，這一看似矛盾的表現可能是不同功能NEU群體的作用以及下游效應分子功能多樣化的原因。進一步研究以完善闡述NEU 在UC 中的作用機制網絡是必要的。這些新發現提示在臨床上采取靶向NEU的治療手段時，考慮到平衡NEU 的促炎癥和保護性作用對于提高療效有著重要意義。

上皮層NEU 活動狀態是評估UC 組織學炎癥的最佳指標[36]。有研究提倡將NEU 相關的組織學緩解作為UC的治療目標以改善患者的長期臨床預后[35]。但目前尚缺乏NEU 相關的組織學緩解的統一定義，這為開展相關臨床試驗、對比研究數據，乃至應用于臨床診療實踐帶來困難。此外，NEU 相關生物標志物在各項研究中靈敏度和特異度檢測結果存在異質性，缺乏統一的檢測閾值。尚需更新檢測技術和統計分析算法，推動更大規模、高質量的研究進一步篩選出能夠滿足UC特異性要求的理想生物標志物及其相應的標準檢測流程和檢測閾值。未來應推動高質量的多中心隨機對照臨床試驗開展NEU 在UC 診斷、療效評估、預后評估等方面的研究，以利于進一步優化UC的臨床診療實踐。