單純皰疹病毒Ⅰ型在三叉神經節潛伏復發機制的研究進展

董亞慧,趙 格,周慶軍

0 引言

單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type Ⅰ, HSV-1)感染所致的單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是一種全球性的嚴重致盲性眼病。HSV-1在角膜初發感染后被轉運至三叉神經節(trigeminal ganglion,TG)進入潛伏狀態,在宿主免疫能力下降等因素的影響下,潛伏的HSV-1會再次活化,并轉運至原發感染部位,引起HSK的復發[1],臨床主要表現為角膜知覺減退、新生血管和瘢痕化,最終需行角膜移植復明。根據統計,雖然92%的正常人淚液中可以檢測到HSV-1的DNA[2],但只有28%～32%的患者會出現復發的癥狀[3],在我國人群中HSK的患病率為11/10000[4]。同時,HSV-1初發感染癥狀較輕,甚至無明顯癥狀,臨床上最常見的是復發性HSK。因此,闡明HSV-1在三叉神經節內潛伏復發的分子機制對于HSK的臨床防治十分重要。

1 HSV-1感染潛伏的基本過程

HSV-1是一種典型的嗜神經病毒。目前的研究發現:角膜上皮細胞表達一系列介導HSV-1感染的蛋白,如Nectin 1,HVEM(herpes virus entry mediator),PILR-α(paired immunoglobulin-like type 2 receptor-alpha)[5-6],病毒感染后在角膜上皮細胞內完成其復制組裝過程,而后擴散至角膜上皮層中的三叉神經節末梢,并沿三叉神經節軸突反向轉運至神經元胞體,在胞體中病毒基因組整合到宿主細胞核中,并通過宿主的調控機制轉錄,最終導致大量復制或者建立潛伏。研究表明,通過神經元軸突逆行轉運感染胞體的途徑容易建立潛伏,而直接感染胞體或樹突則更易導致病毒的大量復制[7-8]。HSK初發感染后潛伏的建立,是由病毒自身的調控以及神經元胞體的特殊結構所導致的宿主反應共同影響的[1]。在三叉神經節細胞中,病毒裂解相關的基因表達受到明顯抑制,其部分DNA序列整合到宿主細胞基因組中,只表達潛伏相關轉錄體(latency-associated transcripts,LAT),最終完成HSV-1在三叉神經節細胞中的潛伏。

2 HSV-1在三叉神經節潛伏的調控機制

雖然早在1973年即已證實HSV-1在角膜感染后轉運至三叉神經節內潛伏[9],但又經過10余年的探索,研究者才逐漸發現HSV-1病毒自身和宿主反應都參與并維持著其在三叉神經節內潛伏的調控。

2.1 病毒的調控

2.1.1 抑制病毒增殖性基因的表達人受HSV原發感染后,HSV常在感覺神經節中終身潛伏,有時也能在迷走神經、腎上腺組織和腦中檢出。病毒的DNA以游離環狀附加體(episome)形式存在。潛伏狀態下只有很少的病毒基因表達。研究表明,病毒進入神經元的位置可影響病毒增殖性基因的表達,從而對感染結果有相當大的影響[7]。一些病毒相關的調節因子,例如病毒的細胞溶解啟動蛋白VP16,在軸突中的運輸相當低效,這樣就能通過抑制增殖性基因的高效表達來促進潛伏。實驗發現,軸突途徑感染所導致的潛伏,可被胞體途徑的二次感染破壞,二次感染的病原體使用的是可釋放VP16的病毒或是具有類似刺激作用的復合物。VP16蛋白的缺乏可降低幾種早期毒力基因(immediate-early gene)的表達,其中包括ICP0——一種重要的病毒基因表達調控因子,可拮抗宿主的抑制因子,且在潛伏模型的復發中也起到重要作用[10]。以上結果強調了神經元在結構上的獨特性質,并警示我們包括HSV-1在內的神經元營養性病毒可以利用這種特性作為自己的感染優勢。

2.1.2 潛伏相關的miRNA miRNA是近代生物醫學研究中最重要的發現,它可為宿主基因提供一種特殊水平的轉錄后調控。多數皰疹病毒在潛伏期間可以產生一定數量的miRNA,進而可以影響病毒和宿主細胞的基因表達。宿主中同樣有miRNA,病毒感染可對其表達產生重要影響[11]。目前主要的研究發現,HSV-1的LAT與其在三叉神經節內潛伏的建立和維持密切相關。LAT類似于哺乳動物細胞中穩定的長鏈非編碼RNA(lncRNA),是一種miRNA前體,可編碼產生幾種不同的miRNA(包括miR-H2-3p、miR-H6、miR-I等),從而可以在宿主細胞中抑制幾種關鍵的毒力因子ICP0、ICP4和ICP34.5的表達[11-13]。LAT在潛伏期的TG內大量轉錄,主要通過下調病毒增殖性基因的表達和抵抗宿主神經元凋亡兩種機制維持HSV-1在TG內的潛伏[14]。與LAT相關的miRNA(如miR-LAT和miR-I)可以通過影響TGF-β信號通路介導的抗凋亡功能,控制HSV-1毒力因子ICP34.5表達的開關功能來調控HSV-1在神經細胞中的潛伏和復發[12,15]。

2.1.3 抵抗宿主神經元壞死盡管維持HSV潛伏感染和控制復發頻率的病毒基因編碼機制依然不甚明確,但已有重要證據顯示HSV-1中的LAT有助于維持病毒的長期潛伏,并能保護感染的宿主神經元免于壞死的命運。在小型動物模型中,缺乏LAT基因的突變病毒依然能夠復制和建立潛伏,然而卻更易復發。小鼠的體內實驗表明,在三叉神經節中,LAT可以影響潛伏感染的神經元的絕對數量,但在頸背根神經節中就沒有這種影響,說明這與感染途徑或神經元類型也有一定關系[16]。神經元特異的miR-138能夠通過抑制病毒即早期毒力基因ICP0的表達和促進神經細胞的存活[17]來維持潛伏。

2.1.4 表觀遺傳調控一些機制與毒力基因沉默相關,其中包括表觀遺傳調控(甲基化和乙?；?。研究者用小鼠三叉神經節細胞為感染模型進行染色質免疫沉淀(ChIP)實驗,來探究潛伏期HSV-1的游離環狀附加體基因組成。結果顯示與毒力調節基因相關的組蛋白帶有抑制性染色質的典型標記,即組蛋白3的第9位賴氨酸(H3K9me2/3)和第27位賴氨酸(H3K27me3)的二甲基化或三甲基化,還有降低的組蛋白乙?；潭萚18-19]。

2.2 宿主的調控

2.2.1 潛伏的維持在潛伏的建立過程中,HSV-1基因組可能通過宿主DNA的修復機制,被核心組蛋白以規律排列的核小體形式組裝起來。包括轉錄活躍區在內的所有基因組關鍵區域,都被證明與核小體有關,該結構被認為在HSV-1潛伏過程的基因表達中起重要作用[20]。所有潛伏的皰疹病毒采用相似的排列形式,這也許就是它們不整合基因組卻可以長期在細胞中維持的原因[21]。

早在一個世紀之前,人們在治療三叉神經痛時,發現相應神經的創傷可引發其所支配的皮膚區域的皰疹[22],這最終使人們意識到,感覺神經節是復發病毒的來源之處,且復發極有可能是因為神經失去了營養支持。許多細胞能夠分泌神經生長因子(NGF)——一種首次被認可的神經營養因子。NGF可以結合膜相關受體,即由NGF依賴性感覺和交感神經元所表達的酪氨酸激酶TrkA。TrkA受體被NGF激活后產生信號,持續激活的PI3-K/Akt信號通路,對維持HSV-1在神經細胞內的潛伏起關鍵作用(圖1),此通路一方面可通過活化下游具有調節蛋白翻譯功能的mTOR(mammalian target of rapamycin)因子來抑制HSV-1即早期毒力因子的表達,另一方面可誘導抗細胞凋亡的功能促進細胞的存活,從而促進并維持HSV-1在神經細胞內潛伏[23-24]。Du等[25-26]利用潛伏感染的小鼠TG器官培養模型證明抗NGF的抗體可以促進HSV-1的活化,地塞米松誘導的凋亡可以加速潛伏的HSV-1的再活化,這些都進一步驗證了NGF激活的通路和抗凋亡功能在HSV-1神經細胞內潛伏的重要性。

圖1 PI3-K/Akt信號通路對HSV-1神經細胞內潛伏的調控作用示意圖[23]。

2.2.2 免疫的調控自體免疫系統在病毒性角膜炎中發揮重要作用,新近發現該系統的表面活性蛋白(SP)A和D在角膜炎中至關重要,SP通過對病毒配體的高度親和,抑制其黏附宿主細胞,進一步促進吞噬病毒,同時SP調節免疫細胞功能,保持組織在病毒感染早期的非炎癥狀態,而在病原菌入侵、機體呈應激狀態時,SP-A和SP-D又能促進炎癥反應,幫助殺滅病原菌[27]。

HSV原發感染后1wk左右,血中出現中和抗體(IgM、IgG、IgA)。嚴重的原發感染或經常性復發感染,抗體水平有所增高。這些抗體不能阻止重復感染或潛伏病毒的復發,但可以減輕疾病的嚴重程度。目前研究發現,宿主免疫相關因子、miRNA以及細胞存活相關信號通路參與調控了HSV-1在宿主體內的潛伏,T細胞對維持HSV-1潛伏狀態、抑制復發起關鍵作用。當機體受到多種因素如紫外照射(太陽暴曬)、壓力等刺激下的應激反應、性激素改變、免疫抑制劑的應用、糖皮質激素、角膜移植創傷等[28-33],潛伏的病毒被激活,病毒沿感覺神經纖維軸索下行至神經末梢,感染上皮細胞。上述條件同樣可以導致機體免疫失調,產生復雜的免疫反應,多項動物實驗研究表明,應激狀態會減少駐三叉神經節CD8+T細胞和記憶細胞毒性T淋巴細胞(CTLm)產生,并促進生成IL-6等促炎細胞因子,導致HSV-1從潛伏期重新激活[34]。潛伏感染的神經元也可以刺激免疫系統產生病毒特異性的CD8+T細胞,對三叉神經節中的CD8+T細胞進行處理,使其功能增強或數量增加,可抑制復發[35]。而最新研究表明,反復激活HSV-1可誘導局部HSV特異性CD8+T細胞的衰竭,而阻斷有癥狀患者宿主細胞的衰竭通路可恢復CD8+T細胞的保護作用從而減少復發[36],特定的病毒抗原決定簇的表達會產生具有免疫優勢的CD8+T細胞群[37],這些成果為HSK的免疫靶向治療提供了新方向。

3 存在的問題

3.1 潛伏的基因組是否都可被重新激活大多數潛伏感染的神經元都包含多種游離環狀附加體,但不能確定是否這些附加體擁有一致的染色質結構,也不明確它們是否有相同的復發能力。有關感染的進一步研究顯示,只有有限數量的整合基因組可以在單個細胞中成功復制,但引起這種限制的原因尚未可知[38]。

3.2 防治手段缺乏目前,針對HSV的不同治療方式正在逐漸更新,局部和全身治療都有其特定的治療模式,有時聯合療法也可以提高其治療效果[39]。還寄希望于疫苗,特別是新型疫苗,如亞單位疫苗、重組活疫苗、DNA疫苗的研究。在對動物模型進行紫外照射復發前,用毒力減弱的HSV-1病毒作為疫苗產生免疫反應,角膜發病程度減輕,小鼠體內抗HSV抗體增多[40]。在抗HSV的藥物中,臨床常用的有無環鳥苷(acyclovir)、丙氧鳥苷(ganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)等。這些藥物均能抑制病毒DNA合成,使病毒在細胞內不能復制,從而減輕臨床癥狀,但不能徹底防止潛伏感染的再發。隨著研究的不斷深入,人們對病毒的潛伏復發機制了解的愈加透徹,Pegg等[41]深入研究了嗜神經病毒的神經侵襲機制,并證明這些嗜神經病毒可以將首輪感染的上皮細胞中的驅動蛋白同化為一種必需的前病毒結構組件,繼而繼續感染神經元細胞,這一原理可能同樣存在于其他病毒系列的感染機制,還有近年來對皰疹病毒從潛伏期重新激活后從感覺神經元到上皮組織的順行轉運能力的研究也在不斷完善[42],這些成果都為抗擊病毒復發提供了新思路。

4 小結

反復發生的角膜炎癥反應可導致角膜敏感度降低、瘢痕形成甚至失明,但類似的癥狀并不能作為診斷復發性HSK的確鑿證據。HSK患者在發現初發感染癥狀時,應及早請醫生確診,積極治療。目前,HSK主要依據裂隙燈檢查中的臨床表現來診斷,但文獻中并沒有確切的診斷標準。其他檢查如聚合酶鏈式反應測定、酶聯免疫吸附測定,免疫熒光抗體和病毒培養可提供更明確的診斷,但也有一定的局限性。目前的治療方式僅能在減少角膜損傷和控制病毒擴散兩方面展開,尚未有治愈措施[43]。