過表達CTRP9抑制ApoE基因敲除小鼠肝臟脂肪病變

李向宇,艾樂樂,劉玉琪,梁國朵,相奧琪,陳曉暢,余 琦,關 華,2

(1.西安醫學院基礎與轉化醫學研究所,陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室,西安 710021;2.西安交通大學醫學部實驗動物中心,西安 710067)

C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9(C1q/tumor necrosis factor-related protein 9,CTRP9)是一種新發現的脂肪因子,是脂聯素最接近的同源物[1-2]。CTRP9蛋白水解釋放其球狀結構域(global CTRP9,gCTRP9),作為主要循環亞型和功能單位存在于生物個體內[3]。在與脂聯素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和N-鈣黏蛋白結合(N-cadherin)后,CTRP9激活各種信號通路以調節葡萄糖和脂質代謝[4]、血管舒張和細胞分化[5]。以往研究證明CTRP9可有效地抵抗心肌缺血再灌注后模型動物的炎癥反應[6],以及其對2型糖尿病[7]、胰島素抵抗和肥胖[8]、肺動脈高壓[9]、心力衰竭[6]、心肌梗死和動脈粥樣硬化[10]等也具有有益作用,抑制CTRP9表達能夠顯著加劇野生型C57BL/7J小鼠肝臟脂肪病變[11]。載脂蛋白E(ApoE)是所有血漿脂蛋白的重要組成部分,ApoE基因突變與脂肪變性和肝損傷密切相關[12-13]。本研究探討CTRP9對高脂血癥模型ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝臟脂肪病變形成的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

雄性SPF級ApoE-/-小鼠30只,8周齡,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[北京百善SCXK(京)2016-0006]。將30只小鼠隨機分為觀察組與對照組,每組15只,對照組小鼠給予尾靜脈注射腺病毒空載綠色熒光蛋白(adenovirus green florence protein,Ad-GFP),觀察組小鼠給予尾靜脈注射腺病毒Ad-CTRP9。2組小鼠注射病毒后均飼喂高脂高膽固醇飲食(HF/HC)12周,飼料成分為21%脂肪+0.15%膽固醇,飼喂至20周齡,采集尾靜脈血,再給予150 mg·kg-1戊巴比妥腹腔注射處死小鼠收集肝臟組織。實驗在西安交通大學實驗動物中心屏障動物房[SYXK(陜)2012-005進行],動物飼養室溫度、光照、噪聲和換氣次數均符合國際要求,自由飲水和采食,所有動物處理程序符合美國NIH實驗動物管理法。

1.2 主要試劑和儀器

伊紅染色液、蘇木素染色劑、酒精購自北京雷根生物技術有限公司;水性封片劑購自廣州凱秀貿易有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(HDL-C)購自中生北控生物科技股份有限公司。冰凍切片機(德國Leika公司,型號:RM2235),圖像分析系統(Image-Pro Plus 6.0),電子天平(瑞士Mettler Toledo公司,型號:AB104-S)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腺病毒CTRP9載體構建與細胞感染

根據文獻[12]方法構建編碼CTRP9重組腺病毒載體(Ad-CTRP9)。將CTRP9 cDNA亞克隆到腺病毒穿梭質粒pAdTrack CMV中。序列確認后,將重組穿梭質粒轉化到BJ5183感受態細胞中。將重組腺病毒包裝并在HEK293A細胞中擴增。純化后,通過TCID50檢測病毒滴度。構建空腺病毒載體(Ad-GFP)作為對照。

1.3.2 血脂水平檢測

HF/HC飲食飼喂12周后,禁食16 h,尾靜脈采血置于EDTA抗凝劑處理的Ep管中,3000 r·min-1,4 ℃離心15 min,取血漿,用商品化檢測試劑盒檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。根據中生北控檢測試劑盒產品說明書,TC采用CHOD-PAP法,TG采用GPO-PAP法,HDL-C采用直接法-過氧化氫酶清除法,LDL-C采用直接法-表面活性劑清除法進行檢測。

1.3.3 油紅O(ORO)染色

從-80 ℃冰箱中取出肝臟組織冰凍切片在室溫復溫30 min,用4%多聚甲醛中固定30 min,蒸餾水沖洗3次,每次1 min;用60%異丙醇溶液預處理15 min,隨后加入0.5%的ORO工作液室溫染色30 min,隨后用60%異丙醇溶液浸洗1 min,蒸餾水輕輕沖洗3次,用水溶性封片劑封片、照相。

1.3.4 蘇木素-伊紅(HE)染色

從-80 ℃冰箱中取出肝臟組織冰凍切片在室溫復溫30 min,用4%多聚甲醛固定30 min,蒸餾水沖洗3次,每次1 min;蘇木素染色10 min;流動水沖洗,1%鹽酸酒精分化10 s,伊紅染色2 min,流動水沖洗3 min,95%乙醇浸洗2 min;100%乙醇浸洗2 min,二甲苯浸洗10 min,中性樹脂封片、照相。

1.3.5 實時PCR(real-time PCR)分析

使用TRIzol Plus(美國Invitrogen公司)提取小鼠肝臟的總RNA,并使用SuperScript?Ⅲ第一鏈合成系統(美國Invitrogen公司)合成cDNA。使用TaKaRa TP800(日本TaKaRa Biology Inc)進行real-time PCR分析。定量轉錄物的數量,并根據其β-actin含量對每個樣品進行標準化。PCR引物序列如表1所示。

表1 靶基因的引物序列

1.3.6 蛋白質印跡(western blotting)

從肝組織提取蛋白質,并通過BCA法測定濃度。從每組中隨機選擇總共6個樣品進行western blotting。分離蛋白質,然后轉移到聚偏氟乙烯膜上(美國Thermo Fisher Scientific Inc)。將膜與每種一級抗體(Ab)孵育如下:抗-CTRP9和抗-b-actin,按照制造商所用說明,在4 ℃下培養過夜,洗滌3次后,將膜與辣根過氧化物酶綴合的二級Ab(1：5000)孵育2 h,使用化學發光檢測系統(美國Millipore公司)建立印跡。

1.3.7 肝脂質分析

將100 mg新鮮肝臟勻漿組織用1.9 mL氯仿-甲醇(2：1)混合物(v/v)稀釋至2 mL,將勻漿提取過夜(4 ℃)并離心(3000 r·min-1,20 min)。用移液管取下相液體100 μL,并轉移至玻璃管中,用氮氣干燥脂質以使氯仿擴散,用50 μL乙醇溶解Ep管底部的脂質并使用商業分析試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)測量肝臟TC和TG。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 CTRP9在肝臟組織中的表達水平

Real-time PCR和western blotting檢測結果顯示,觀察組肝臟組織中CTRP9 mRNA和蛋白表達均較對照組明顯上調(P<0.05或P<0.001),其中基因表達上調約20倍,蛋白表達上調約2倍(P<0.05),見圖1。

A:CTRP9 mRNA表達比較;B:western blotting檢測;C:CTRP9蛋白表達比較;

2.2 體重和血脂水平分析

與對照組相比,觀察組小鼠體重及血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、葡萄糖水平差異無統計學意義(P>0.05),見圖2。

A:體重;B:血清TC水平;C:血清TG水平;D:血清HDL-C水平;E:血清LDL-C水平;F:血清葡萄糖水平。

2.3 肝臟脂肪病變及相關基因表達

肝臟組織HE、ORO染色顯示,與對照組相比,觀察組肝臟組織中脂質蓄積顯著降低(圖3A)。另外,與對照組相比,觀察組肝臟組織中脂質含量顯著降低(P<0.05),其中TC和TG含量分別下降45%和20%(圖3B—C)。

A:肝臟組織HE和ORO染色;B:肝臟組織TC含量;C:肝臟組織TG含量;*P<0.05與對照組(Ad-GFP)相比。

為了進一步確定CTRP9抑制肝臟脂肪病變的機制,利用real-time PCR檢測肝臟組織中相關基因表達。結果顯示:與對照組相比,觀察組肝臟新生脂肪生成相關基因FAS、SCD1,轉錄調節因子SREBP1c,炎癥相關基因MCP-1、MIP1α、IL-1β表達水平顯著下降(P<0.01或P<0.001);脂代謝相關基因PPARα、PPARγ、LXRα、LXRβ,脂肪酸氧化和氧化磷酸化相關基因CPT1、CPT2、COX4、Cytoc、Acadl、Acadm表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),見圖4。表明過表達CTRP9能夠通過促進脂肪酸氧化磷酸化抑制肝臟組織中脂肪生成以及炎癥反應,增加線粒體能量消耗,從而降低肝臟組織中脂質蓄積。

3 討論

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發病率逐年升高,其危害不僅限于肝臟組織,對周身其他器官的代謝功能也產生劇烈影響[14]。NAFLD早期,肝細胞中脂質蓄積導致脂肪樣變,多種細胞因子表達紊亂,線粒體功能障礙以及肝細胞炎癥反應,促使NAFLD發展為非酒精性脂肪肝肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)[15]。在本研究中,給雄性ApoE-/-小鼠飼喂高脂高膽固醇飲食,同時通過尾靜脈注射腺病毒以確保CTRP9表達升高。結果顯示,與對照組相比,盡管過表達CTRP9對小鼠的血脂水平和體重沒有顯著影響,但是肝脂肪病變顯著減少,同時,肝臟組織中TC和TG水平顯著降低。分子生物學實驗進一步證實,肝組織線粒體氧化磷酸化相關基因表達顯著升高,而新生脂肪生成以及炎癥因子相關基因表達顯著下降。表明過表達CTRP9可通過促進肝細胞線粒體氧化磷酸化顯著降低ApoE-/-小鼠脂肪肝形成。

ApoE是所有血漿脂蛋白的重要組成部分,并作為細胞表面脂蛋白受體,如LDL受體的配體。當喂食標準飼料時,ApoE-/-小鼠自發地發生高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化,而HF/HC可進一步加重這些損傷并加速該過程,喂食HF/HC的ApoE-/-小鼠可以作為一種快速且有價值的NAFLD模型[16]。外顯子微陣列分析協同計算機斷層掃描發現,ApoE基因突變與脂肪肝形成顯著關聯[12];基因突變序列分析結果顯示,ApoE基因突變與脂肪變性和肝損傷密切相關[13]。因此,本研究通過檢測喂食HF/HC的ApoE-/-小鼠肝臟中CTRP9的表達,探索CTRP9對脂肪肝形成的潛在機制。

SREBPs屬于bHLH LZ轉錄因子家族,作為二聚體與脂質代謝靶基因SRE,5′-TCACCC-3′結合[17]。作為一個調節脂質合成的主控基因,SREBPs包含3種異構體,SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2,在脂質合成中發揮不同的作用[18]。SREBP-1c肝臟過表達轉基因小鼠證實,其在生脂基因轉錄激活中具有關鍵作用,導致肝臟脂質累積和胰島素抵抗增加[19]。盡管已知SREBP通過結合SRE發揮功能,但由于非典型酪氨酸殘基取代了存在于堿性區域的保守精氨酸,SREBP也可以與E-box域結合[20]。FAS(脂肪酸合酶)作為脂肪酸合成的關鍵基因,-CAT啟動子區包含SRE和E-box結構域[20]。ChIP檢測發現,SREBP1c與FAS啟動子區結合,從而激活FAS基因的表達[21]。本研究中,過表達CTRP9抑制SREBP1c和FAS基因表達,油紅O染色結果顯示肝臟脂肪病變顯著減少,與先前的研究結果相一致。

PPARα(過氧化物酶體增殖物激活受體α)是一種配體激活的轉錄因子,與PPARγ和PPARβ/δ均屬于NR1C核受體亞家族,許多PPARα靶基因參與肌肉、心臟和肝臟等高氧化率組織中的脂肪酸代謝[22]。PPARα激活可改善NAFLD臨床前模型中的脂肪變性、炎癥和纖維化,確定了一個新的潛在治療領域[23]。先前的研究[24-25]證實,PPARα是涉及過氧化物酶體和線粒體β氧化、FA反式轉運和肝葡萄糖生成基因的轉錄調節因子,通過蛋白-蛋白相互作用負調控促炎信號通路,配體激活的PPARα通過干擾AP-1和NFκB信號通路抑制細胞因子誘導的IL-6基因表達,如全身炎癥、動脈粥樣硬化或NAFLD等動物模型中所見。本研究證實,過表達CTRP9促進PPARα基因表達上調,減輕肝臟脂肪變性,繼而上調線粒體氧化磷酸化的基因表達,而炎癥相關基因表達被抑制,與先前的研究結果相一致。

線粒體是參與能量生產和許多代謝過程的關鍵細胞器,在結構上,它們具有包圍膜空間的內、外膜[26]。內膜內是線粒體基質,其中發生重要代謝過程,如三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環[27]。在肝臟脂肪病變過程中,線粒體功能障礙,活性氧生成增加和氧化磷酸化受損。本研究顯示,過表達CTRP9促進氧化磷酸化相關基因表達升高,說明CTRP9激活線粒體氧化磷酸化過程,加快線粒體能量代謝,這一分子機制與肝細胞中脂質蓄積減少相一致。

綜上所述,過表達CTRP9可顯著抑制ApoE-/-小鼠脂肪肝形成,肝臟中TC、TG含量顯著減少。同時,過表達CTRP9可顯著抑制肝臟脂質合成轉錄因子SREBP1c的表達,同時促進線粒體氧化磷酸化相關基因表達顯著上調,表明CTRP9能夠通過改善線粒體氧化磷酸化促進能量代謝、抑制脂質生成2個方面緩解高脂血癥模型中肝臟脂肪病變的形成。