胡麻DNA 指紋圖譜的構建與遺傳多樣性分析

許嘉誠,張夢陽,陳翠萍,閆殿海,劉 洋*

(1 青海大學農牧學院,西寧 810016;2 農業農村部植物新品種測試(西寧)分中心,西寧 810016;3 青海省農林科學院,西寧 810016)

胡麻(Linum usitatissimumL.)又稱油用亞麻,為亞麻科亞麻屬一年生草本經濟作物,是我國北方地區重要的油料作物。 胡麻籽粒富含多種生物活性物質,具有重要的食用價值和營養價值,廣泛應用在天然健康產品中[1]。 據統計,2000—2017 年胡麻的單產水平穩步提升,近十年的胡麻消費量也保持年均11.8%的增長率,市場需求旺盛[2]。 對胡麻的分子研究國內外均有報道,如Bickel 等[3]最早利用AFLP 和RAPD 進行胡麻遺傳圖譜的構建;李丹丹等[4]采用AFLP 分子標記的方法,利用聚類分析將80 個胡麻品種(系)分為4 個種群,并分析了胡麻農藝性狀、胡麻種群劃分、胡麻地理來源之間的相關性;李聞娟等[5]利用篩選的SRAP 引物對胡麻品種‘隴雜1 號’和‘隴雜2 號’進行純度鑒定;郝榮楷等[6]利用形態學標記以及SRAP 分子標記對96 個胡麻品種進行了指紋圖譜的構建與遺傳多樣性分析,并分析了核心種質資源的表型變異[7-8]。 運用SSR 分子標記的胡麻研究始于對引物的篩選[9-11],之后潘根等[12]應用SSR 分子標記分析了24 個胡麻品種,構建了相關的指紋圖譜并進行了遺傳分析,未來將有更多胡麻品種、更多引物位點的相關研究[13]。 目前,國內已建立了初級核心種質資源庫,但利用分子標記輔助選擇技術改良胡麻的研究較少[14]。 因此,構建胡麻DNA 指紋圖譜庫,對其新品種鑒定及種質資源保護具有重要的現實意義和廣闊的研究前景。 本研究采用SSR 標記技術,利用篩選出的20 對多態性好的引物,對61 份胡麻材料構建胡麻DNA 指紋圖譜,以期建立一套穩定、快速、可靠的胡麻品種鑒定體系,為胡麻的品種鑒定和選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料

在青海省農林科學院作物育種栽培研究所收集的200 多份胡麻種質資源中,選取61 份材料作為本研究的試驗材料(表1)。

表1 試驗所用61 份胡麻材料Table 1 Sixty-one flax materials used in the experiment

1.1.2 試驗試劑

試驗試劑10 ×PCR buffer、TaqDNA 聚合酶、dNTPs 等均購于寶生物工程(大連)有限公司;試驗所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取

參照李榮華等[15]的方法提取胡麻DNA。 提取的DNA 樣品經超微量紫外分光光度計檢測,判斷濃度以及純度是否符合試驗標準,并于-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 PCR 擴增

PCR 反應體系為:總體積10 μL,DNA 75 ng,引物1.2 μmol∕L,10 × PCR buffer 1.2 μmol∕L,dNTPs 0.8 μmol∕L,TaqDNA 聚合酶0.2 μmol∕L,用ddH2O 補足。

擴增程序為:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環9 次;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環29 次;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

加入10 μL Loading Buffer 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后,經銀染與顯影得到清晰條帶,進行讀帶分析。

1.3 數據分析

通過讀帶分析記錄同一引物下的等位基因位點數。 在61 個DNA 樣本中同一等位基因位點上有明顯條帶的記作“1”,無明顯條帶則記作“0”,缺失樣本記作“.”,以此做出“0-1”矩陣型讀帶表。 利用Popgen 32 軟件分析讀帶表計算出多態性指數等,采用NTSYSpc 2.1 軟件進行非加權組平均法(UPGMA)聚類分析。

2 結果與分析

2.1 多態性引物的篩選與多態性分析

參考Cloutier 等[16]的分析數據并結合先前研究合成193 對引物。 挑選6 份不同來源的胡麻材料對引物進行初篩,根據初篩結果(圖1)挑選條帶清晰、多態性好的引物;用所有的供試材料進行復篩,最終篩選出構建胡麻指紋圖譜的20 對核心引物(表2)。

圖1 多態性引物的篩選Fig.1 Screening of polymorphic primers

表2 20 對多態性SSR 引物序列信息Table 2 Sequence information of 20 pairs of polymorphic SSR primers

由表3 可知,篩選出的20 對多態性好的引物共擴增出88 個等位基因位點,每個引物的等位基因數在2—12 個,有效等位基因數在1.431—6.547 個,其中引物Lu2796 的等位位點數最多(12 個),引物Lu3218、Lu2966、Lu2382 的等位位點數最少(2 個),其余引物的等位位點數為3—8 個。 多態信息含量(PIC)值在0.120—0.870,平均值為0.508,以引物Lu2796 最高,引物Lu3218 最低。 多樣性指數在0.822—2.015,平均值為1.458,最高為引物Lu2796,最低為引物Lu3218。 引物Lu2796 在有效等位基因數、等位位點數、多態信息含量和多樣性指數上均為最高。 不同引物擴增條帶片段大小在200—450 bp。

表3 SSR 引物多樣性分析指標Table 3 SSR primer diversity analysis indicators

2.2 遺傳多樣性分析

非加權組平均法(UPGMA)聚類分析(圖2)表明:61 份胡麻材料的遺傳相似系數在0.250—0.780;在遺傳相似系數為0.771 5 處可將61 份胡麻材料分為3 類:第一類包括‘內亞5 號’、DEHISCINTK CREDITAN、莎車早熟種紅、雁雜10 號選系-1、‘隴亞六號’等38 個材料;第二類包括‘壩選三號’、‘壩亞九號’、‘壩亞11 號’、KENYAC 1709、Crista Fiber、PALA Blue 等15 個材料;第三類包括10446146、俄羅斯高桿亞麻、‘壩亞七號’、‘壩亞12 號’、慶陽老胡麻、兩當胡麻、‘雁雜10 號’、‘壩亞一號’。 甘肅隴亞系列的‘隴亞1 號’、‘隴亞2 號’、隴亞六號’、‘隴亞10 號’、‘隴亞11 號’、‘隴亞13 號’油用亞麻材料聚類在一起,河北壩亞系列的‘壩亞三號’、‘壩亞九號’、‘壩亞11 號’、‘壩亞13 號’油用亞麻材料聚類在一起,由此也驗證了分子標記的準確性。

圖2 61 份胡麻材料聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 61 flax materials

2.3 指紋圖譜構建

由表4 可見,具有特征引物的材料共有19 個,其中‘隴亞10 號’、‘隴亞2 號’、晉亞5 號選系-2 有最多的特征引物(3 對),此類材料具有較高的特異性,易于鑒別。 莎車亞麻選系-1、‘寧亞6 號’、天水白和兩當胡麻有2 對特征引物。 莎車早熟種紅、平羅紅、‘隴亞11 號’、‘隴亞13 號’、‘晉亞5 號’、‘匈牙利3號’、10446146、‘壩選三號’、CDC Bethune、阿里安、PALA Blue 和KENYAC 1709 各有1 對特征引物。 篩選出的20 對引物對樣品DNA 都具有良好的多態性,能將某一材料從其余60 份材料中篩選出來的特征引物共有13 對(Lu2580F、Lu2184、Lu2794、Lu2796、Lu2764、Lu2292、Lu2700、Lu2420、Lu2810、Lu2105、Lu2162、Lu2778、Lu2486),其中引物Lu2292 可一次區分6 份材料(‘隴亞10 號’、‘隴亞2 號’、晉亞5 號選系-2、‘寧亞6 號’、阿里安、KENYAC 1709)。 能將2—3 份材料從其他材料中篩出合并為一類的共有17 對引物,如Lu2796 可以將Crista Fibe 和PALA Blue 從其他材料中篩出組成一類,Lu2580F 可將‘晉亞5 號’與OTT7703*ARGCB*AR*C19 從其他材料中篩出組成一類。 利用2 對或2 對以上的引物構建指紋圖譜可提高鑒別的準確性,組合運用這類引物可改進鑒定過程,提高鑒定效率。

表4 61 份胡麻材料鑒別的引物組合Table 4 Primer combinations for identification of 61 flax materials

綜上,組合利用上述20 對多態性引物可將61 份胡麻材料DNA 完全鑒別。 第一步:利用Lu2105 將61 份胡麻材料DNA 分為十大類。 其中有兩大類各只有1 份材料(天水白、兩當胡麻),第三大類為‘隴亞2 號’、晉亞5 號選系-2,第四大類為褐籽胡麻、范尼、CDC Bethune、KOREN,第五大類為‘壩選三號’、壩選三號選系-1、DEHISCINTK CREDITAN、低亞麻酸,第六大類為莎車早熟種紅選系-1、莎車早熟種紅選系-2、寧亞11 號選系-1,第七大類為莎車亞麻選系-1、平羅紅、F-13-1、F-13-3、F-13-3 選系-2、俄羅斯矮桿亞麻、東鄉白,第八大類包括慶陽老胡麻、F-13-4、雁雜10 號選系-1 等8 份材料,第九大類包括‘壩亞七號’、‘壩亞14 號’、F-13-5 等13 份材料,第十大類包括西禮白、‘隴亞1 號、‘壩亞11 號’等18 份材料。 第二步:利用Lu2700 在這幾大類中篩選,將‘隴亞10 號’、‘隴亞13 號’、俄羅斯高桿亞麻、‘隴亞11 號’、隴亞11 號選系-2、‘隴亞1 號’、‘內亞5 號’等13 份材料從其他材料中分出。 第三步:組合其他引物將剩余材料篩選出來,如組合Lu2184 與Lu2486 將第九大類中的8 份材料全部鑒別出來。 對這20 對多態性引物在61 份材料中的擴增結果,以十進制數字0—9 進行編碼,構建61 份胡麻材料的DNA 指紋圖譜(表5),并根據《農作物種子標簽二維碼編碼規則》[17]中的二維碼設計標準進行QR 碼的繪制(圖3)。

表5 61 份胡麻材料的DNA 指紋序列Table 5 DNA fingerprint sequences of 61 flax materials

圖3 部分胡麻材料的唯一QR 標識碼Fig.3 Unique QR identification code of some flax materials

3 討論與結論

自Gorman 等[18]在1996 年首次利用分子標記技術研究胡麻以來,應用于胡麻的分子標記研究不斷增加。 目前常用的分子標記包括AFLP、RAPD、SSR 以及SNP。 Bickel 等[3]和李丹丹[4]對胡麻遺傳連鎖圖譜構建的研究采用的是AFLP、RAPD 和SRAP 標記方法,但存在標記數量少、對試驗樣品的DNA 質量要求較高、試驗步驟復雜且穩定性較差的問題,在如今的研究中,這三類標記方法逐漸被取代[19];作為第三代分子標記的SNP 分子標記擁有穩定性高、位點豐富、檢測快速、易于實現自動化分析等優點,其高效的測序技術與易于實現的自動化分析對未來的遺傳圖譜構建速度有著極大的提升作用[20-21],但不斷增加的分子標記數量的成本問題及計算效率與技術限制的矛盾亟待解決,所以SNP 測序技術更適合于開發大量的、準確的分子標記。 而SSR 標記技術具有高多態性、共顯性以及在基因組中豐度較高且操作簡便省時、成本低等諸多優點,已用其建立了水稻、小麥、玉米等作物的分子遺傳圖譜[22-24],因此從降低成本、操作簡便等因素考慮,本試驗采用SSR 分子標記的方法。

本研究利用20 對SSR 引物將61 份胡麻材料進行遺傳多樣性分析,并構建出61 份材料的指紋圖譜,繪制了胡麻材料的QR 標識碼。 結果表明:相同選系材料,如莎車早熟種紅、莎車早熟種紅選系-1、莎車早熟種紅選系-2 分為一類,‘隴亞六號’、隴亞六號選系-1、隴亞六號選系-2 分為一類,但也出現了‘雁雜10號’與雁雜10 號選系-1 并未在同一類的情況,可能是自然突變或機械混雜導致的;甘肅隴亞品系分為一類,河北壩亞品系分為一類,表現出明顯的地域特征。 該結論與黃文功等[25]對7 個國家48 個亞麻品種ISSR 分析的結論相符,地理相近的品種在聚類分析中基本歸為一類。 因此,可通過聚類分析結果進行胡麻育種中親本的選配,并根據育種目標選育多態性更好的品種來豐富胡麻基因資源的多樣性。 本試驗篩選的20 對引物等位基因位點共有88 個,其中多態性等位基因位點有87 個,多態性比率為98.86%,高于潘根等[12](多態性比率25%)和黃文功等[25](多態性比率91.1%)的研究結果,說明本試驗篩選的20 對引物具有很高的多態性,可以廣泛應用于胡麻的SSR 分析中。