基于基因組微衛星的團頭魴養殖群體遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建

張芹　王延暉　王冰柯　屈長義　劉英杰

摘要 利用基因組微衛星檢測2個團頭魴（Megalobrama amblycephala）養殖群體的遺傳多樣性，18個位點共檢測到126個等位基因，大小在135～362 bp。各位點觀測等位基因數（Na）在3～15個，平均為7個；有效等位基因數（N）在1.250～6.979，平均為3.603。各位點檢測到的香農信息指數（I）在0.417～2.213，平均為1.384。觀測雜合度（H）在0.219～0.856，平均值為0.647；期望雜合度（H）在0.200～0.857，平均值為0.665。多態信息含量指數（PIC）在0.190～0.843，平均值為0.624。群體間的遺傳分化指數（F）為0.070，群體間的基因交流（N）為1.59，說明HH和YH 2個群體之間有一定程度基因流。2個位點檢測到的近交系數（F）>0，其他16個位點近交系數均<0。研究表明，HH和YH兩個人工養殖群體中均有較高的遺傳多樣性，群體間有一定程度的基因交流，指紋圖譜的構建可以用來進行團頭魴種質資源品種間的鑒定以及品種內的親緣關系研究，尤其是可以區分沒有親緣關系數據背景的群體，可以指導沒有家系構建能力的苗種繁育場進行繁殖策略的升級。

關鍵詞團頭魴；基因組；SSR；多態性

中圖分類號S917文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0099-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.023開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Genetic Diversity Analysis and Fingerprint Construction for Two Cultured Populations of Megalobrama amblycephala? on Genomic Microsatellites

ZHANG Qin，WANG Yan-hui，WANG Bing-ke et al（Henan Academy of Fishery Sciences，Zhengzhou，Henan 450044）

AbstractIn this study，the genetic diversity for two populations of Megalobrama amblycephala was detected using genomic SSR.The results showed that 126 alleles were detected in 18 microsatellite loci，ranging from 135 bp to 362 bp.The observed heterozygosity ranged from 3 to 15，with mean value of 7.The expected heterozygosity ranged from 1.250 to 6.979，with mean value of 3.603.The Shannon information index was between 0.417 and 2.213，with an average of 1.384.The observed heterozygosity was between 0.219 and 0.856，with an average of 0.647.The expected heterozygosity was between 0.200 and 0.857，with an average value of 0.665.The polymorphism information content ranged from 0.190 to 0.843，with mean value of 0.624.The genetic differentiation index between the populations was 0.07，and the gene flow was 1.59，indicating that there was a certain degree of gene flow between the two populations.The inbreeding coefficients at two loci were greater than zero，and at the other 16 loci were all less than zero.In summary，the genetic diversity among the two pupulaitons was mid-high，and there was a certain degree of gene exchange between the two populations，which showed that all the artificial selection breeding strategies for the two cultural populations could maintain population diversity.There was a large genetic difference between wild individuals and cultured populations，which could be used as an effective supplement for the genetic diversity of Megalobrama amblycephala in later breeding process.Using these tags，the fingerprint was constructed for two Megalobrama amblycephala group.These microsatellite loci can be used for identification and genetic relationship research of megalobrama amblycephala germplasm resources.Especially，these tags can be used to distinguish pupulations with no pedigree data background and then to guide strategies for breeding ground without family building capacity.

Key wordsMegalobrama amblycephala;Genome;SSR;Polymorphism

團頭魴（Megalobrama amblycephala）為我國特有的淡水經濟魚類，因其生長快、成活率高、易捕撈、肉質好等優點，在全國各地均有養殖。團頭魴“華海1號”水產新品種經第五屆全國水產原種和良種審定委員會審定通過，具有遺傳性狀穩定、生長快、成活率高等優良特征［1］?！耙梁郁櫋痹诜诸惿蠈儆隰檶賵F頭魴，是近年來開發黃河流域土著魚類品種時，選育出來的一個優良新品系［2］。微衛星標記（microsatellite）由于重復性好，多態性高，廣泛應用于水生動物的種質資源鑒定以及遺傳多樣性研究［3-4］，尤其是利用SSR的多態性對水生生物進行親子鑒定的較多［5-7］。李寶玉等［8］利用微衛星標記對團頭魴二倍體和三倍體群體進行遺傳特性分析，Xiong等［9］利用微衛星技術對團頭魴群體不同家系的肌間刺數量進行研究，而有關團頭魴基因組微衛星研究鮮見報道。筆者對團頭魴基因組SSR序列進行分析，篩選得到若干多態性微衛星SSR標記，筆者利用這些標記，對2個團頭魴養殖群體進行遺傳多樣性研究和指紋圖譜的構建，旨在為團頭魴種質資源品種間的鑒定以及品種內的親緣關系研究提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料在河南省嵩縣陸渾水庫伊河魴魚種廠采集團頭魴伊河群體100尾，以下簡稱YH群體；從湖北省鄂州國家級團頭魴原種場采集團頭魴“華海1號”群體100尾，以下簡稱HH群體；在湖北省鄂州市梁子湖采集野生團頭魴個體2尾，以下簡稱LZH個體。所有個體測量體長、體重，剪尾鰭用無水乙醇保存備用。

1.2方法

1.2.1團頭魴DNA的提取。團頭魴DNA用磁珠法基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取，經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用超微量分光光度計（NanoDrop One spectrophotometer）檢測 DNA 濃度和純度，置于 -20 ℃低溫保存。

1.2.2PCR擴增及SSR檢測。挑選出18對微衛星引物［10］，使用 M13 通用接頭序列（TGTAAAACGACGGCC AGT）加到每對引物的 F 引物的 5′方向，并合成帶不同熒光基團的 M13 接頭序列。

PCR 反應體系（15 μL）：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，Mix primer 2.0 μL，基因組DNA模板 1.0 μL（50～200ng），dd HO 4.5 μL。PCR擴增條件：96 ℃ 預變性 3 min（96 ℃ 變性 30 s，59～60 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min）共 30個循環，72 ℃ 終延伸 10 min，12 ℃保存。

1.2.3熒光毛細管電泳檢測。取3 μL熒光PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測PCR條帶是否單一、片段大小是否與預期一致。條帶單一且大小相符的，對照DNA Marker的濃度進行定量，將所有產物稀釋至相同的濃度范圍，取1 μL PCR稀釋產物加10 μL甲酰胺（含0.5μL內標）變性后上DNA測序儀ABI 3730xl進行毛細管熒光電泳檢測。

1.2.4結果整理。將毛細管電泳檢測結果導入GeneMarkerV2.2.0 分析軟件中對原始數據進行條帶分型，每對引物導出PDF峰圖文件，結果匯總統計后進行分析。

各位點等位基因數（N）、有效等位基因數（N）、觀測雜合度（H）、期望雜合度（H）等遺傳多樣性參數使用GenAIex軟件計算，各位點的多態信息含量指數（PIC）由Cervus軟件計算，群體Hardy-Weinberg 平衡偏離用固定指數F衡量，使用GenAIex軟件進行群體的哈代溫伯格平衡檢驗。群體間的聚類分析運用 Phylip 軟件對其進行 UPGMA方法構建系統發生樹。群體間遺傳分化系數（F）、地方群體內近交系數（F）、基因差異分化系數（G）、分子方差、PCA分析由GenAIex軟件進行運算，熱點圖為R語言繪制。連鎖不平衡使用R包poppr的pair.ia方法進行分析，圖用R語言繪制。

2結果與分析

2.1各位點遺傳多樣性參數由表1可知，采用的基因組微衛星位點均為多態性位點，18個位點共檢測到126個等位基因，大小在135～362 bp。各位點觀測等位基因數目（N）在3～15個，平均數為7個；有效等位基因數（N）在1.250～6.979，平均值為3.603。各位點檢測到的香農信息指數（I）在0.417～2.213，平均值為1.384。觀測雜合度（H）在0.219～0.856，平均值為0.647；期望雜合度（He）在0.200～0.857，平均值為0.665。多態信息含量指數（PIC）在0.190～0.843，平均值為0.624。各位點檢測到的遺傳分化指數（F）值0.010～0.174，平均值為0.070。在ZQTTF079和ZQTTF257兩個位點檢測到的近交系數（F）>0，其他位點近交系數均<0?；蛄鳎∟）為1.185～25.302，平均值為6.047。HH群體在ZQTTF079、ZQTTF124、ZQTTF149、ZQTTF157、ZQTTF209和ZQTTF262位點上顯著偏離哈代溫伯格平衡，YH群體在ZQTTF023、ZQTTF050、ZQTTF079、ZQTTF112、ZQTTF124、ZQTTF149、ZQTTF209、ZQTTF252位點上顯著偏離哈代溫伯格平衡，其中ZQTTF079、ZQTTF124、ZQTTF149、ZQTTF209 位點在2個群體中都顯著偏離哈代溫伯格平衡。

2.22個群體各位點的遺傳多樣性參數由表2可知，HH群體檢測到的觀測等位基因數目平均值為5.889，有效等位基因數平均值為2.827，香農信息指數平均值為1.212，觀測雜合度平均值為0.624，期望雜合度平均值為0.612；YH群體檢測到的觀測等位基因數目平均值為5.222，有效等位基因數平均值為3.057，香農信息指數平均值為1.202，觀測雜合度平均值為0.671，期望雜合度平均值為0.616。

2.3群體遺傳結構HH和YH 2個群體之間的F為0.07，說明二者間存在中等程度的分化。2個群體間的基因流（N）為1.59，說明二者間有一定程度基因交流。

團頭魴群體的分子方差分析結果（表3）顯示，群體間的差異占差異來源的13.06%，個體間的差異較小，差異的主要來源在個體內部，占總差異的83.26%。個體內部的差異是指由雜合等位基因引起的遺傳差異，大小與個體雜合位點數相關，即個體的遺傳多樣性，由此可知2個養殖群體的個體內部存在著豐富的遺傳多樣性。

根據遺傳距離繪制的群體間系統發生樹（圖1），YH群體和HH群體首先聚合在一起，然后再與LZH群體聚合在一起，說明YH群體和HH群體之間的遺傳距離更近，而2個養殖群體離LZH群體之間的遺傳距離更遠。

PCA（Principal co-ordinates analysis）用來研究樣本群體組成的相似性或相異性（圖2），HH群體的個體幾乎集中分布在同一個區域，YH群體內的個體也是集中分布在另一個區域，而LZH的個體離2個集中分布的區域均較遠，單獨分布在一個區域。說明這3個群體之間存在一定程度的分化，個體之間有較明顯的遺傳差異。

在連鎖不平衡中，一般通過r值平方來表征連鎖不平衡程度，18個位點兩兩之間r值平方在0.02～0.34（圖3），說明位點之間存在一定程度的連鎖不平衡。

利用在線工具STRUCTURE HARVESTER 進行群體結構分析，參數設置如下：混合模型（admixture model）；Burn-in值為10 000，MC值為100 000；K值設置為3～10，每個K值重復20次。軟件對每個K值模擬的結果，都會對應產生最大似然值（likelihood），最大似然值是取自然對數后輸出的數值（ln likelihood）。ln likelihood越大，說明K值越接近于真實情況。一般隨著K值升高，ln likelihood值也會不斷升高，但會慢慢進入平臺期，選擇最優K值的目標是要找到拐點。該研究最佳K值為3（圖4），根據最佳K值估計群體數為3（圖5），說明試驗所檢測的樣品最佳可劃分為3個群體。

2.4利用DNA 指紋圖譜鑒別2個團頭魴群體 根據2個養殖群體在 18 個微衛星位點上的擴增結果，按照表1中的編號順序，利用EXCEL 作圖軟件構建這2個群體的 DNA 指紋模式圖（圖 6）。

從指紋圖譜庫中可以篩選出 6個特異的微衛星 DNA 標記（ZQTTF124、149、050、106、209和023）用以鑒別這 2 個群體，每個標記至少在其中一個群體中可以擴增出獨有的條帶，從而將這2個群體區分開。而將這6個標記配合使用，則可以將群體中99%的個體區分開來，這 6 個特異微衛星標記產生的多態位點可作為團頭魴育種過程中種質鑒定的依據。

3討論

3.1群體遺傳多樣性分析該研究觀測等位基因數和有效等位基因數差別較大，則等位基因在2個群體中分布不均勻。團頭魴養殖群體檢測到的平均等位基因數目高于團頭魴二倍體和三倍體群體［8］、鱖魚［11］、魴鲌雜交及回交F2群體［12］、三角魴×翹嘴鲌、團頭魴×翹嘴鲌2種雜交后代［13］、團頭魴耐低氧新品系雌核發育群體［14］和海蜇群體［15］；觀測等位基因數和有效等位基因數低于大口黑鱸［16］和刺參群體［17］，高于花鱸群體［18］。等位基因情況反映出團頭魴2個養殖群體與其他水產養殖品種相比處于較高水平，一方面說明2個養殖群體保持了較高的遺傳多樣性，另一方面說明選擇得到的基因組微衛星位點具有較高的遺傳多樣性，能夠反映出團頭魴群體的遺傳背景。

該研究團頭魴養殖群體檢測到的觀測雜合度和期望雜合度均低于團頭魴群體［9］和鱖魚群體［11］，高于三角魴×翹嘴鲌、團頭魴×翹嘴鲌2種雜交后代［13］、海蜇群體［15］和花鱸群體［18］。觀測雜合度高于刺參群體［17］，低于團頭魴耐低氧新品系雌核發育群體［14］；期望雜合度低于刺參群體［17］，高于大口黑鱸群體［16］和團頭魴耐低氧新品系雌核發育群體［14］。觀測雜合度和期望雜合度與魴鲌雜交及回交F2群體［12］相比處于中等水平。綜合來看，該研究團頭魴養殖群體的觀測雜合度和期望雜合度與其他水產養殖品種相比處于中等水平。

通過固定指數可以衡量種群中基因型的實際頻率是否偏離Hardy-Weinberg平衡［19］，刺參［17］和團頭魴耐低氧新品系［14］中大量位點表現為雜合子過剩。HH群體在6個位點上顯著偏離哈代溫伯格平衡，YH群體在8個位點上顯著偏離哈代溫伯格平衡，說明人工選擇育種過程給養殖群體造成了一定的選擇壓力。其中，4個位點在2個群體中都顯著偏離哈代溫伯格平衡，可見這4個位點在不同的選育策略中都承受了較大的選擇壓力，可在今后的選育過程中予以特別關注，以期進一步了解與位點相關的性狀以及選育過程對其帶來的影響。

該研究中微衛星位點檢測到的多態信息含量指數（PIC）在0.190～0.843，平均值為0.624，高于鱖魚群體［11］、三角魴×翹嘴鲌、團頭魴×翹嘴鲌2種雜交后代［12］、團頭魴耐低氧新品系［14］和花鱸群體［18］，低于團頭魴群體［9］和刺參群體［17］，與魴鲌雜交及回交群體［12］接近。2個團頭魴養殖群體的多態性較高，與等位基因衡量的結果一致。18個微衛星位點中有16個位點的PIC值均大于0.5，其中大于0.7的位點有5個，說明試驗中采用的微衛星位點是高度多態的［20］，能夠為群體遺傳信息監測提供豐富、高質量的數據。

3.2群體遺傳結構分析遺傳分化指數（F）是反映群體間遺傳差異的重要參數［21］，各位點檢測到的遺傳分化指數（F）值0.010～0.174，平均為0.070；在檢測的18個位點中，9個位點屬于輕度分化位點（0＜F≤0.05），7個位點屬于中度分化位點（0.05＜F≤0.15），2個位點屬于高度分化位點（0.15＜F≤0.25）。群體間的F為0.070，說明2個群體屬于中度分化群體［22］，群體間遺傳變異不顯著。HH和YH 2個群體間的基因流（N）為1.59，說明2個養殖群體之間有一定程度基因交流。

基因差異分化系數（Gst）可以不必考慮地方群體形成歷史、遷移方式、群體中等位基因數和基因型頻率，只需將整個群體中雜合體頻率分解為地方群體間變異和地方群體內變異［23］。各位點檢測到的Gst范圍在0.007～0.172，群體間有一定的遺傳分化。

地方群體內近交系數（F）對地方群體內的繁育系統具有指示意義，在ZQTTF079和ZQTTF257 2個微衛星位點檢測到的近交系數F>0，其他16個位點近交系數F<0，2個群體近交現象很少，2個群體在18個位點的F值的范圍在-0.184～0.166，接近于0，說明群體比較接近于隨機交配群體。各位點檢測到的近交系數說明2個養殖群體在選育種過程中參與繁殖的親本較多，群體保持較好的遺傳多樣性。

基因流（N）均大于1，就能有效抑制由遺傳漂變而引起的遺傳分化［24］。群體間基因流為1.59，群體間存在一定程度基因流，18個位點檢測到的基因流（N）大于1，其中8個位點基因流大于5。推測原因可能是伊河魴群體選育時間較短，河南地區養殖的團頭魴苗種較多來源于湖北地區，養殖群體逃逸及放流的個體給伊河流域的團頭魴種群帶來了一定程度的基因交流。

群體最佳K值即為最佳群體分層情況［25-26］，張智等［27］對西昌華吸鰍進行種群結構分析，計算得出K=2是比較理想的種群亞型類群數目，遺傳分化分析結果相一致。高玉坤等［28］對馬鈴薯品種（系）的群體遺傳結構進行分析， 65 個品種（系）劃分為3個群體。該研究最佳K值為3，樣品可劃分為3個群體，與實際團頭魴采樣群體情況一致，與群體間聚類結果也一致。

3.3團頭魴指紋圖譜數據庫的應用熒光標記SSR可以區分親緣關系遠的品種，也能將親緣關系很近的個體區分開［29］。筆者利用 18 個微衛星標記，繪制了 2 個團頭魴養殖群體的微衛星 DNA 指紋圖譜，篩選到 6 個能特異性鑒別這2個養殖群體的微衛星標記，將這6個標記配合使用，可以有效區分群體內的個體。該研究采集的樣品沒有遺傳背景數據，篩選出的標記可以對這些個體進行準確區分，利用這些特異性譜帶可以鑒定未知樣本，是群體種質純度鑒定的有效手段，可以用來指導親本遺傳背景不清晰或者沒有家系構建能力的良種繁育場進行繁殖策略的升級。

4結論

HH和YH 2個人工養殖群體中的個體都有較高的遺傳多樣性，表明所采取的人工選擇育種策略都能夠保持群體的多樣性。YH群體保持較大的親本選育群體是檢測到低水平近交的主要原因。由于長江禁漁，僅采集到很少量的野生個體，野生個體與養殖群體存在較大的遺傳差異，可以作為后期育種過程中遺傳多樣性的有效補充。利用熒光標記SSR構建DNA指紋圖譜，可以精確區分同一群體內的不同個體，在團頭魴土著品種進行搶救性選育過程中，可以建立有效的繁育體系，并對子代進行精準鑒定。

參考文獻

［1］ 王衛民，高澤霞，劉紅，等.團頭魴“華海1號”［J］.中國水產，2018（5）：65-70.

［2］ 張芹，孔令軍，屈長義，等.伊河團頭魴2 種同工酶組織特異性分析［J］.中國漁業質量與標準，2020，10（5）：37-43.

［3］? NAPORA-RUTKOWSKI ，RAKUS K，NOWAK Z，et al.Genetic diversity of common carp （Cyprinus carpio L.） strains breed in Poland based on microsatellite，AFLP，and mtDNA genotype data［J］.Aquaculture，2017，473：433-442.

［4］ DAS MAHAPATRA K，SAHOOL，SAHA J N，et al.Establishment of base population for selective breeding of catla （Catla catla） depending on phenotypic and microsatellite marker information［J］.Journal of genetics，2018，97（5）：1327-1337.

［5］ LIU Y，CHEN Y Y，GONG Q，et al.Paternity assignment in the polyploid Acipenser dabryanus based on a novel microsatellite marker system［J］.PLoS One，2017，12（9）：1-15.

［6］ XU X J，WANG G Z，ZENG C S，et al.Parentage determination of the mud crab Scylla paramamosain using microsatellite markers［J］.Aquaculture research，2018，49（1）：217-221.

［7］ WANG P P，ZHAO C，CHEN S Q，et al.Parentage identification of Odontobutis potamophlia based on microsatellite DNA markers［J］.Journal of genetics，2018，97（2）：563-568.

［8］ 李寶玉，鄭國棟，崔文濤，等.團頭魴三倍體的微衛星遺傳特征及生長性能分析［J］.水產科學，2022，41（2）：173-182.

［9］ XIONG X M，ROBINSON N A，ZHOU J J，et al.Genetic parameter estimates for intermuscular bone in blunt snout bream （Megalobrama amblycephala） based on a microsatellite-based pedigree ［J］.Aquaculture，2019，502：371-377.

［10］ 張芹，王延暉，王冰柯，等.團頭魴基因組微衛星特征及SSR位點開發［J］.江蘇農業科學，2022，50（3）：79-85.

［11］ 周夢晨，徐東坡，方弟安，等.6個不同群體鱖基于SSR的遺傳多樣性初步研究［J］.中國農學通報，2020，36（26）：147-152.

［12］ 崔文濤，鄭國棟，蘇曉磊，等.魴鲌雜交及回交F2群體的微衛星遺傳結構及其生長性能分析［J］.中國水產科學，2020，27（6）：613-623.

［13］ 蘇曉磊，鄭國棟，蔣霞云，等.三角魴×翹嘴鲌、團頭魴×翹嘴鲌兩種雜交后代微衛星遺傳結構分析［J］.水生生物學報，2019，43（2）：264-271.

［14］ 徐湛寧，李福貴，鄭國棟，等.團頭魴耐低氧新品系雌核發育群體遺傳結構的微衛星分析［J］.水產學報，2017，41（3）：330-338.

［15］ 狄明玉，周遵春，李云峰，等.海蜇４個自然群體遺傳多樣性的微衛星標記分析［J］.水產科學，2018，37（6）：762-768.

［16］ 蘇勝彥，張林兵，李海洋，等.基于微衛星標記的大口黑鱸（Micropterus salmoides）原種和養殖群體遺傳多樣性和結構分析［J］.浙江大學學報（農業與生命科學版），2020，46（6）：687-698.

［17］ 廖梅杰，王錦錦，李彬，等.基于SSR 標記的刺參不同地理群體的遺傳結構分析及指紋圖譜構建［J］.漁業科學進展，2021，42（1）：165-176.

［18］ 黃皓，范嗣剛，王鵬飛，等.基于微衛星標記對6 個花鱸群體的遺傳多樣性分析［J］.南方水產科學，2022，18（1）：99-106.

［19］ BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms ［J］.American journal of human genetics，1980，32（3）：314-331.

［20］ PURVIS I W，FRANKLIN I R.Major genes and QTL influencing wool production and quality：A review ［J］.Genetics selection evolution，2005，37 （S1）：S97-S107.

［21］ BALLOUX F，LUGON-MOULIN N.The estimation of population differentiation with microsatellite markers［J］.Molecular ecology，2002，11（2）：155-165.

［22］ NEI M.Genetic distance between populations ［J］.The American naturalist，1972，106（949）：283-292.

［23］ NEI M.Analysis of gene diversity in subdivided populations ［J］.Proceedings of the national academy of sciences of the United States of American，1973，70（12）：3321-3323.

［24］ WRIGH T S.Evolution in Mendelian populations［J］.Genetics，1931，16（2）：97-159.

［25］ PRITCHARD J K，STEPHENS M，DONNELLY P.Inference of population structure using multilocus genotype data［J］.Genetics，2000，155（2）：945-959.

［26］ 劉清文，宋躍，李甲明，等.利用核心簡單重復序列（SSR）標記分析西洋梨品種資源遺傳多樣性［J］.農業生物技術學報，2015，23（5）：579-587.

［27］ 張智，俞丹，劉飛，等.西昌華吸鰍的微衛星引物篩選及赤水河四個地理種群的遺傳多樣性分析［J］.水生生物學報，2019，43（6）：1224-1230.

［28］ 高玉坤，崔江慧，項曉冬，等.65個馬鈴薯品種（系）指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析［J］.農業生物技術學報，2020，28（8）：1363-1378.

［29］ 陶乃奇，張斌，劉信凱，等.利用熒光標記SSR鑒別21個茶花新品種［J］.植物學報，2019，54（1）：37-45.