地高辛和歐夾竹桃苷抑制RNA病毒復制的功能研究

廖夏琳?梁巍?陳嘉雯?劉坤鵬

【摘要】目的 研究強心苷類藥物地高辛和歐夾竹桃苷的抗病毒能力。方法 采用人肺泡腺癌基底上皮細胞（A549細胞）和非洲綠猴腎細胞（vero細胞），利用細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8法）確定強心苷類藥物地高辛和歐夾竹桃苷的細胞毒性，利用逆轉錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白免疫印跡法檢測地高辛、歐夾竹桃苷對水皰性口炎病毒（VSV）和腦心肌炎病毒（EMCV）以及仙臺病毒（SeV）和甲型流感病毒（H1N1）復制的影響。利用天然的IFN信號通路缺陷的vero細胞結合熒光顯微技術、RT-qPCR、蛋白免疫印跡法分析地高辛、歐夾竹桃苷抗病毒的作用機制是否依賴IFN信號通路。在敲低鈉鉀腺苷三磷酸（ATP）酶α1亞基（ATP1A1-shRNA）的vero細胞中，通過RT-qPCR、蛋白免疫印跡法等檢測細胞內病毒復制及細胞的抗病毒IFN反應。結果 地高辛和歐夾竹桃苷可抑制VSV、H1N1、SeV和EMCV基因表達；結合使用IFN缺陷的vero細胞證明地高辛和歐夾竹桃苷發揮抗病毒作用不依賴于IFN信號通路；在敲低ATP1A1的vero細胞中，地高辛和歐夾竹桃苷不再有明顯的抗病毒作用。結論 地高辛、歐夾竹桃苷等強心苷類藥物具有較廣譜的抗病毒能力，主要通過抑制細胞膜內外鈉/鉀離子轉運蛋白發揮抗病毒作用。

【關鍵詞】地高辛；歐夾竹桃苷；抗病毒；先天免疫；鈉鉀腺苷三磷酸酶；水皰性口炎病毒；甲型流感病毒；呼吸道病毒；腦心肌炎病毒

Function of inhibition of RNA virus replication by digoxin and oleandrin Liao Xialin， Liang Wei， Chen Jiawen， Liu Kunpeng. Biotherapy Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Liu Kunpeng， E-mail： liukp5@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To evaluate the antiviral ability of cardiac glycosides of digoxin and oleandrin. Methods Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cell line （A549） and African green monkey kidney cell line （vero） were used for subsequent experiment. The cytotoxicity of cardiac glycosides of digoxin and oleandrin was assessed by CCK-8 assay. The effects of digoxin and oleandrin on the replication of vesicular stomatitis virus （VSV）， encephalomyocarditis virus （EMCV）， Sendai virus （SeV） and influenza A virus （H1N1） were determined by reverse transcription-real-time quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blot. Vero cells with natural interferon （IFN） signaling pathway defects combined with fluorescence microscopy， RT-qPCR and Western blot were employed to analyze whether the antiviral mechanism of digoxin and oleandrin depended on IFN signaling pathway. In vero cells with ATP1A1 （sodium potassium ATPase protein 1） （ATP1A1-shRNA） knockdown， intracellular virus replication and antiviral IFN response were detected by RT-qPCR and Western blot. Results Digoxin and oleandrin could inhibit the expression levels of VSV， H1N1， SeV and EMCV mRNA. The combination of IFN-deficient vero cells demonstrated that digoxin and oleandrin played an antiviral role independent of IFN signaling pathway. Meantime， digoxin and oleandrin exerted no antiviral effect in vero cells with ATP1A1 knockdown. Conclusion Digoxin， oleandrin and other potent cardiac glycosides have a broad spectrum of antiviral capability mainly through the inhibition of Na+/K+ ion transporters intra- and extra-cell membrane.

【Key words】Digoxin； Oleandrin； Antivirus； Innate immunity； Na+/K+-ATPase； Vesicular stomatitis virus；?Influenza A virus； Respiratory virus； Encephalomyocarditis virus

目前已知強心苷是一類具有加強心肌收縮力、減慢心率作用的苷類有機化合物，其家族部分化合物常用于心力衰竭等慢性心功能不全的治療，包括地高辛、洋地黃毒苷等［1］。強心苷的作用機制主要是抑制鈉離子/鉀離子（Na+/K+）通道蛋白的活性，進而減少心肌細胞膜內外Na+/K+交換。細胞內Na+增多可激活心肌細胞鈉離子/鈣離子（Na+/Ca2+）交換系統，促使細胞內Na+外流同時促進Ca2+轉移入細胞膜內［2］。心肌細胞內游離Ca2+濃度升高，能夠增強心排出量、增加回心血量，緩解心力衰竭［3］。強心苷類藥物在心血管系統的強心活性已廣為人知，近年有研究顯示強心苷類藥物可以調節免疫系統，具有一定的抗腫瘤活性［4-5］。也有報道認為強心苷類化合物有抗病毒應用潛力［6］。在抗新型冠狀病毒（新冠病毒）的藥物篩選研究中，有學者發現歐夾竹桃苷等強心苷類藥物有較強的抑制新冠病毒復制能力［7-8］。已知下調細胞中鈉鉀腺苷三磷酸（ATP）酶α1亞基（ATP1A1）蛋白表達對宿主細胞內的病毒復制有很強的抑制作用。但是強心苷類藥物是否具有廣譜的抗病毒能力，目前筆者尚未查及有相關的研究。本研究立足于探索強心苷類藥物的抗RNA病毒復制能力，使用臨床上最廣泛使用的強心苷類藥物地高辛和已知有一定抗病毒能力的歐夾竹桃苷處理經RNA病毒感染的細胞，檢測細胞內病毒復制情況及細胞的抗病毒IFN反應，從而探討地高辛和歐夾竹桃苷這兩種強心苷藥物的廣譜抗RNA病毒活性，為強心苷類藥物的抗病毒研究和應用提供科學依據。

材料與方法

一、細胞與病毒

所有實驗均于本實驗室（生物安全防護二級）中開展。人肺泡腺癌基底上皮細胞（A549細胞）和非洲綠猴腎細胞（vero細胞）購自美國模式菌種收集中心（ATCC），均采用富含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的高糖DMEM培養基，于

37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養。ATP1A1蛋白敲低vero細胞（ATP1A1-shRNA vero）由本實驗室構建（shRNA序列：5′-TACCGAGCTCGGATCCtctagtctccagcaacagga-3′），攜帶綠色熒光蛋白的水皰性口炎病毒（VSV-GFP）、水皰性口炎病毒（VSV）和腦心肌炎病毒（EMCV）以及仙臺病毒（SeV）和甲型流感病毒（H1N1）由本實驗室保存，病毒擴增后置于?80 ℃保存，病毒使用滴度即感染復數（MOI）值為0.1［9-10］。

二、主要試劑與儀器

地高辛、歐夾竹桃苷購自成都普思生物科技股份有限公司。Gibco DMEM高糖培養基，轉染試劑Invitrogen Lipofectamine 3000購自美國Thermo Fisher Scientific公司。FBS購自美國PEAK公司；SYBR Green PCR Master Mix Kit購自Genstar公司；超敏化學發光底物（ECL）發光液購自美國Advansta公司；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8法）購自美國APExBIO有限公司；山羊抗兔IgG-HRP抗體購自美國CST公司；VSV-G抗體購自美國Abcam公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

LC480熒光定量PCR儀為瑞士Roche公司產品；Proflex 96型PCR儀為美國Thermo Scientific公司產品；Biofuge pico 17微量離心機為美國Thermo Scientific公司產品；Eclipse Ti2-U型熒光倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品；SW-CJ-1F超凈工作臺為上海安泰分析儀器有限公司產品；PowerPac型基礎電泳儀為美國Bio-Rad公司產品；1285 Series A2 型生物安全柜為美國Thermo Scientific Forma公司產品。

三、方 法

1. 藥物制備

地高辛10 mg直接加入0.256 mL的二甲基亞砜（DMSO）溶液，振蕩至澄清狀態，即為

50 mmol/L母液，分裝后儲存于?80 ℃備用。歐夾竹桃苷10 mg直接加入0.346 mL的DMSO水溶液，然后充分振蕩至液面完全澄清，即為50 mmol/L母液，分裝后儲存于?80 ℃處備用。

2. 細胞活力檢測

采用CCK-8法，于96孔板中每孔細胞按照1.5×104密度接種，放置于培養箱中至完全貼壁；將地高辛、歐夾竹桃苷母液（50 mmol/L）用DMEM高糖培養基稀釋至相應摩爾濃度（0、1、10、25、50 ?mol/L），按照每孔100 ?L溶液體積緩慢加入細胞中，每組設3個復孔，培養24 h后吸棄上清，再往每孔中加入配好的CCK-8混合溶液，孵育1.5 h，待培養基變至橙黃色，立即用酶標儀檢測450 nm處光密度（OD）值，細胞存活率（%）=［（OD實驗組?OD空白組） /（OD對照組?OD空白組）］×100%。

3.逆轉錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

于6孔板中，以每孔約1.2×106的密度接種A549細胞或vero細胞，至細胞完全貼壁后，再以MOI為0.01的VSV病毒、H1N1病毒、SeV病毒、EMCV病毒等分別對細胞進行感染，設對照組、病毒模型組、1 ?mol/L地高辛組、10 ?mol/L地高辛組、1 ?mol/L歐夾竹桃苷組和10 ?mol/L歐夾竹桃苷組（在檢測ATP1A1-shRNA vero細胞中VSV-GFP病毒復制的影響時，增設DMSO組），共孵育24 h后，然后在每孔中添加500 ?L的TRIzol 試劑以收集細胞，再進行RNA提取，根據試劑盒說明書進行逆轉錄，RT-qPCR分析：采用SYBR Green PCR Master Mix Kit反應體系，數據歸一化為18S基因，并根據2-ΔΔCt法計算出mRNA相對表達量。擴增引物序列見表1。

4.蛋白免疫印跡法

于24孔板中以每孔2.4×105密度接種A549細胞，過夜培養后以MOI為0.005的VSV病毒感染A549細胞24 h，同時加入1、10 ?mol/L的地高辛或歐夾竹桃苷共同培養，同時設置對照組和病毒模型組。共孵育24 h后收集樣品，使用BCA法進行細胞蛋白定量，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。經過濕法轉膜、5%脫脂牛奶封閉后，與稀釋好的一抗于4 ℃孵育過夜，次日取出用TBST緩沖液洗3次，再與山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，最后顯影觀測目的條帶的變化趨勢。

5.免疫熒光檢測

細胞按前述方法設組，經藥物和病毒處理到達收樣時間后，用4%多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖液清洗2次，置于倒置熒光顯微鏡下，使用明場視野拍攝細胞圖像（曝光時間15 ms，10倍鏡）。使用395 nm激發光波長激發熒光，曝光時間200 ms，10倍物鏡下檢測細胞內熒光。

四、統計學處理

使用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析。正態分布的計量資料采用? 表示，2組間比較采用t檢驗，多組比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、地高辛和歐夾竹桃苷對A549細胞、vero細胞無毒濃度的確定

地高辛和歐夾竹桃苷在最高摩爾濃度為

50 ?mol/L時，細胞存活率仍達到80%左右，見圖1。后續選取兩種藥物對細胞無明顯細胞毒性的低濃度1 ?mol/L、中濃度10 ?mol/L進行研究。

二、地高辛和歐夾竹桃苷對A549細胞中VSV、H1N1、SeV和EMCV 病毒復制的影響

免疫熒光結果顯示，與對照組比較，病毒模型組GFP陽性細胞比例較高；與病毒模型組比較，1、10 ?mol/L的地高辛組和歐夾竹桃苷組中的GFP陽性細胞比例較低，見圖2A。RT-qPCR結果顯示，6組的VSV mRNA相對表達量比較差異有統計學意義（F = 1 670.000，P < 0.001），病毒模型組VSV mRNA表達較高（P < 0.001）；地高辛組和歐夾竹桃苷組VSV mRNA相對表達量較低（P < 0.001），且10 ?mol/L 地高辛組和歐夾竹桃苷組抑制效果明顯（P < 0.001），見圖2B。蛋白免疫印跡法結果顯示，病毒模型組抗VSV病毒G（VSV-G）蛋白表達強度高于對照組，在分別加入了1、10 ?mol/L

地高辛和10 ?mol/L歐夾竹桃苷后，抗VSV-G蛋白表達強度均減弱，其中以10 ?mol/L地高辛組和

10 ?mol/L歐夾竹桃苷組抑制效果更為明顯，見圖2C。利用VSV結合H1N1、SeV、EMCV共同感染A549細胞后，6組的H1N1、SeV、EMCV mRNA相對表達量比較差異均有統計學意義（F分別為872.700、254.800、639.500，P均< 0.001），病毒模型組的病毒mRNA相對表達量比對照組升高（P < 0.001）；而加入地高辛和歐夾竹桃苷后病毒mRNA相對表達量均降低（P均< 0.001），見圖2D。

三、地高辛和歐夾竹桃苷對vero細胞中VSV、H1N1、SeV和EMCV病毒復制的影響?熒光成像結果表明，1 ?mol/L地高辛組和

1 ?mol/L歐夾竹桃苷組中GFP陽性的vero細胞明顯減少，見圖3A。故后續選1 ?mol/L地高辛和1 ?mol/L歐夾竹桃苷進行實驗。RT-qPCR結果顯示，4組的VSV mRNA相對表達量比較差異有統計學意義（F = 1 859.000，P < 0.001），與病毒模型組比較，1 ?mol/L地高辛組和1 ?mol/L歐夾竹桃苷組的病毒mRNA相對表達量均降低（P均< 0.001），見圖3B。vero細胞感染H1N1、SeV和EMCV等RNA病毒時，4組的H1N1、SeV、EMCV mRNA相對表達量比較差異均有統計學意義（F分別為568.200、427.600、471.900，P均 < 0.001），地高辛和歐夾竹桃苷具有良好的抗病毒功能，并且這2種藥物在低濃度時（1 ?mol/L）也有較強的抗病毒效果，見圖3C。

四、地高辛和歐夾竹桃苷對ATP1A1-shRNA vero細胞中VSV-GFP病毒復制的影響

經驗證，本實驗室成功構建ATP1A1慢病毒敲低的vero細胞（ATP1A1-shRNA vero）（t = 21.600，P < 0.001），見圖4A。熒光結果顯示，與病毒模型組比較，下調ATP1A1蛋白的表達與加入地高辛和歐夾竹桃苷后的GFP陽性細胞明顯減少，見圖4B。RT-qPCR顯示，5組的VSV、EMCV、H1N1 mRNA相對表達量比較差異有統計學意義（F分別為643.700、426.500、322.900，P均< 0.001），與病毒模型組比較，ATP1A1-shRNA vero細胞組病毒mRNA相對表達量下降（P < 0.001），地高辛和歐夾竹桃苷對于缺失ATP1A1的vero細胞抑制VSV、EMCV和H1N1病毒感染無明顯影響（P均> 0.05），見圖4C。

討論

RNA病毒具有高變異頻率的特性，較難通過靶向性藥物針對單個病毒進行治療，近年出現的人畜共患起源的新冠病毒證明了這一點，目前仍缺乏針對冠狀病毒感染的強力抗病毒藥物［11］。因此，尋找廣譜的強效抗病毒藥物，是靶向治療RNA病毒感染性疾病的有效策略。由ATP1A1編碼Na+/K+-ATP酶的催化α亞基能夠參與多種病毒在宿主細胞內的復制過程，如新冠病毒感染和細胞內復制；通過基因沉默靶向ATP1A1可抑制病毒在宿主細胞內的復制階段，提示靶向抑制Na+/K+通道蛋白可能是一種有效的廣譜抗病毒策略［12］。

目前已有的強心類藥物大多靶向抑制Na+/K+通道蛋白。本研究使用強心苷性類藥物地高辛和歐夾竹桃苷，通過RT-qPCR、蛋白免疫印跡等技術，證明了地高辛和歐夾竹桃苷單獨處理可在細胞水平顯著抑制VSV、EMCV、H1N1和SeV病毒復制。由于vero細胞不能分泌IFN，因此受到病毒感染時可直接反映宿主細胞的抗病毒免疫狀態［13］。本研究進一步通過在vero細胞中感染不同種RNA病毒，得出強心苷藥物并非作用于IFN信號通路來發揮抗病毒功能。已知敲低Na+/K+通道蛋白ATP1A1能夠顯著抑制病毒在宿主細胞內的復制［14-15］。本研究顯示，在ATP1A1敲低的vero細胞中，地高辛和歐夾竹桃苷的抗病毒作用不明顯，說明由ATP1A1可能在地高辛和歐夾竹桃苷增強宿主抗病毒反應中發揮重要的作用。本研究進一步揭示了強心苷類藥物發揮抗病毒效應的部分分子機制，為地高辛和歐夾竹桃苷的抗病毒研究提供科學依據。

綜上所述，強心苷類藥物可能是一種較為有潛力的RNA病毒包括冠狀病毒感染治療方法，其通過抑制Na+/K+通道蛋白進而發揮抗病毒活性的具體分子機制將是下一步研究的重點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-03-03）

（本文編輯：林燕薇）