小金蝠蛾幼蟲血細胞對病原真菌的免疫防御研究

賀元川 游華建 陳仕江

摘要 ［目的］研究小金蝠蛾幼蟲血細胞對不同病原菌侵染的細胞免疫響應差異，揭示擬棒束孢病害發生和冬蟲夏草菌形成機理的細胞免疫差異。［方法］利用光學顯微鏡觀察小金蝠蛾幼蟲感染病原菌后血細胞的數量、形態變化、細胞免疫反應和黑化反應，以L-多巴為底物，采用分光光度法測定感染不同時間后的血淋巴中酚氧化酶活性。［結果］小金蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草菌的生存曲線無顯著差異，血細胞對冬蟲夏草菌無明顯的集結、包囊、黑化等免疫作用，酚氧化酶活性侵染初期出現降低，然后逐漸恢復至健康幼蟲水平；小金蝠蛾幼蟲感染粉棒束孢的生存曲線具有顯著差異，對感染早期血細胞具有明顯的集結、包囊、黑化等免疫響應，酚氧化酶活性初期降低后逐漸升高。［結論］小金蝠蛾幼蟲血細胞對病原真菌冬蟲夏草菌和粉棒束孢免疫防御響應策略具有顯著差異，血細胞對冬蟲夏草菌無明顯的免疫反應，對粉棒束孢雖然有強烈的免疫反應，但是不能阻止粉棒束孢的快速萌發而導致幼蟲短期內死亡。

關鍵詞 小金蝠蛾；血細胞；細胞免疫；粉棒束孢；冬蟲夏草菌

中圖分類號 Q962 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0164-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.040

Abstract ［Objective］ To study the differences in cellular immune responses of the blood cells of the larvae of Thitarodes xiaojinensis to infection by different pathogens，and to reveal the differences in cellular immune responses to the occurrence of Isaria farinosa disease and the formation mechanism of Ophiocordyceps sinensis.［Method］Optical microscopy was used to observe the number，morphological changes，cellular immune responses and melanization reactions of blood cells in the larva of Thitarodes xiaojinensis after infection with pathogenic bacteria were observed，using Ldopa as the substrate，the activity of phenol oxidase in hemolymph after different times of infection was measured by spectrophotometry.［Result］There was no significant difference in the survival curve of the larvae infected with Ophiocordyceps sinensis，and there was no significant immune effect of blood cells on Ophiocordyceps sinensis，such as aggregation，encapsulation and melanization.The activity of phenol oxidase decreased at the initial stage of infection，and then gradually recovered to the level of healthy larvae.There was significant difference in the survival curve of the larvae infected with Isaria farinosa，the blood cells had significant immune responses such as aggregation，encapsulation and melanization in the early stage of infection，the phenol oxidase activity decreased initially and then gradually increased.［Conclusion］The immune defense response strategies of the blood cells of the larvae of Thitarodes xiaojinensis to the pathogenic fungi Ophiocordyceps sinensis and Isaria farinosa had significant differences.The blood cells had no significant immune response to Ophiocordyceps sinensis，and although they had a strong immune response to Isaria farinosa，they cannot prevent the rapid germination of Isaria farinosa，leading to the shortterm death of the larvae.

Key words Thitarodes xiaojinensis;Hemocytes;Cellular immunity;Isaria farinosa;Ophiocordyceps sinensis

基金項目 重慶市自然科學基金項目（cstc2019jcyj-msxmX0679）;重慶市技術創新與應用發展專項面上項目（CSTB2022TIAD-GPX0067）；重慶市科技局技術創新與應用發展專項項目（cstc2020jscx-msxmX0102）。

作者簡介 賀元川（1985—），女，四川隆昌人，副研究員，碩士，從事冬蟲夏草的人工培殖與野生撫育研究。*通信作者，研究員，從事冬蟲夏草的培殖、野生撫育及開發利用研究。

冬蟲夏草是藏區農牧民的主要經濟來源，在經濟和藥用價值上具有重要的地位。冬蟲夏草菌和粉棒束孢是蝙蝠蛾科幼蟲的兩大主要病原真菌，但是致死效率明顯不同。在冬蟲夏草的室內培殖中發現，小金蝠蛾幼蟲若被粉棒束孢病害侵染，則在短期內死亡，并快速生長產生孢子繼代傳染，導致病害的暴發，造成嚴重的損失［1-2］。冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲后則在其體內長期共存，當體內蟲菌體達到一定濃度時導致幼蟲僵死，并形成珍稀名貴中藥材冬蟲夏草［3］。昆蟲在長期的自然進化中慢慢形成了一套獨特的先天免疫系統，主要通過細胞免疫和體液免疫共同抵御真菌、細菌、病毒等外源病原物的入侵。細胞免疫是昆蟲免疫的首道屏障，血細胞通過對病原物進行吞噬、結節及包囊等作用，再通過信號傳遞，激活體液免疫的抗菌肽、溶菌酶、凝集素等細胞因子的表達，并配合血細胞免疫建立一個完整且開放的防御系統［4］。吞噬作用是由單個血細胞清除入侵病原物和細胞凋亡殘體的過程，但是不同種類病原物血細胞的吞噬速度不同［5-8］；結節和包囊作用是由血淋巴細胞在促進細胞黏附的細胞因子參與下在入侵病原物的表面層聚集形成“鞘”狀結構，使病原物在包囊中窒息而死，或被昆蟲自身產生的免疫相關因子消滅［9-10］。昆蟲的血細胞從形態上區分，主要包括原血細胞、漿細胞、粒細胞、類絳色細胞和珠血細胞。原血細胞是分化其他幾種血細胞的干細胞［10］。漿細胞和粒細胞在鱗翅目昆蟲中所占比例最高，是昆蟲細胞免疫的主力，主要黏附外源刺激物［11］。珠血細胞主要參與表皮的物質運輸，類絳色細胞中富含酚氧化酶前體，主要參與黑化作用［10，12］。以家蠶為模式生物研究結果表明，鱗翅目幼蟲感染早期反應是血細胞黏附的激活，導致吞噬作用、結節形成，粒細胞和漿細胞是參與這些反應的血細胞主要類型［13］。

小金蝠蛾（Thitarodes xiaojinensis）屬于鱗翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆蟲，是冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）的優勢寄主昆蟲之一［14］，主要分布在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣，其幼蟲被冬蟲夏草菌成功侵染后將形成名貴中藥材冬蟲夏草，具有抗腫瘤、抗過敏、雙向免疫調節等功能［15］，若被粉棒束孢侵染，則會短期內死亡，并逐漸感染周圍幼蟲，致使幼蟲的大量死亡。小金蝠蛾幼蟲的血細胞種類與鱗翅目昆蟲血細胞的分類基本一致，其中粒細胞的占比最高。小金蝠蛾幼蟲的血細胞免疫功能完善，對釀酒酵母的刺激可發生正常的吞噬和結節，對大型的外源物可正常發生包囊反應［16］。針對小金蝠蛾幼蟲的2種常見病原真菌感染短期內出現截然不同的后果，目前鮮有文獻報道，關于小金蝠蛾幼蟲對不同病原真菌的免疫防御的研究仍為空白，為了探索小金蝠蛾幼蟲對不同病原菌感染初期的細胞免疫差異，該研究主要以6齡小金蝠蛾幼蟲為試驗對象，觀察小金蝠蛾幼蟲對病原真菌感染的細胞免疫，測定幼蟲血淋巴中參與黑化的酚氧化酶的活性變化，闡述小金蝠蛾幼蟲對不同病原菌感染的免疫防御策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲。

小金蝠蛾幼蟲為甘孜州康定貢嘎中華蟲草產業有限公司康定基地室內人工繁育的第3代幼蟲，取蛻皮后10 d的6齡小金蝠蛾幼蟲，飼養溫度12～15 ℃，相對濕度60%～80%，以珠芽蓼、鵝絨委陵菜飼喂。

1.1.2 試驗用菌株。

冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis，OS）和粉棒束孢（Isaria farinosa，IF）均由重慶市中藥研究院冬蟲夏草研究所實驗室提供。

1.1.3 主要試劑及器材。

Ringer’s生理鹽水（RS）配制：NaCl 8.05 g、KCl 0.42 g、CaCl2 0.18 g，超純水定容至1 L，pH調至7.4。過飽和PTU-Ringer’s生理鹽水配制：將過量的苯基硫脲（PTU）加入至Ringer’s生理鹽水（pH 7.4）中，振蕩、溶解后，0.22 μm濾膜過濾后備用。德國徠卡 DM2500P偏光顯微鏡；G0146W酚氧化酶試劑盒，購于江蘇格銳思生物科技有限公司；96孔細胞培養板，購于NEST公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生存率曲線繪制。

分別將2 μL的Ringer’s生理鹽水（RS）、冬蟲夏草菌（OS）、粉棒束孢（IF）孢子液體注射至健康的6齡小金蝠蛾幼蟲體內，并以生理鹽水組的小金蝠蛾幼蟲為對照，將感染組和對照組飼養7 d，每12 h記錄幼蟲的死亡頭數，計算存活數，匯總記錄結果輸入DPS 9.50軟件中，根據DPS 9.50軟件中專業統計-生存分析項下的kaplan-Meier模型繪制生存曲線，并使用LogRank檢驗不同處理與生理鹽水對照組之間差異顯著性。

1.2.2 小金蝠蛾幼蟲血常規涂片制作與觀察。

各取健康的6齡小金蝠蛾幼蟲6頭，剪斷腹足取血淋巴并收集至EP管后，將血淋巴與過飽和PTU-Ringer’s生理鹽水等比混勻后2 μL于載玻片上，并用蓋玻片覆蓋，吸走多余液體，置于光學相差顯微鏡下觀察各類血細胞形態并鑒別，記錄同一視野中各類細胞的數量，計算各類細胞所占百分比。

1.2.3 小金蝠蛾幼蟲血細胞對病原菌免疫防御觀察。

分別將2 μL的Ringer’s生理鹽水（RS）、1×105 CFU/mL的冬蟲夏草菌（OS）、1×105 CFU/mL的粉棒束孢（IF）注射至健康的6齡小金蝠蛾幼蟲體內，觀察感染1 h血細胞與病原真菌的相互作用，并在1、12、24、48 h后取血淋巴計數。

1.2.4 小金蝠蛾幼蟲血淋巴中酚氧化酶活力的測定。

分別將2 μL的Ringer’s生理鹽水（RS）、1×105CFU/mL的冬蟲夏草菌（OS）、1×105CFU/mL的粉棒束孢（IF）注射至健康的6齡小金蝠蛾幼蟲體內，每次定時（1、4、8、12、24、48、72 h）抽取3頭小金蝠蛾幼蟲，剪斷腹足取血淋巴收集預先加入苯基硫脲的1.5 mL EP管中防止黑化，4 ℃、4 000 r/min 離心20 min后，取上清作為待測液體，按照酚氧化酶試劑盒的說明書測定血淋巴上清液中酚氧化酶的活性。

2 結果與分析

2.1 小金蝠蛾6齡幼蟲血細胞種類

小金蝠蛾幼蟲的血細胞與其他齡翅目昆蟲一致，從形態上區分，主要包括粒細胞、漿細胞、類絳色細胞和珠血細胞，在6齡幼蟲中未觀察到明顯的原血細胞（圖1A），與倪若堯等［16］的研究結果基本一致。粒細胞被認為是主要的免疫細胞，可對外源入侵的異物進行吞噬，而漿細胞主要對異物進行包圍，形成包被組織。

粒細胞和漿細胞細胞質內富含黑色的顆粒物，可能參與黑化免疫反應［10］。從圖1B可以看出，小金蝠蛾6齡幼蟲粒細胞所占比例最高，占比為81.59%，其次是漿細胞（13.47%）和珠血細胞（3.18%），占比最低的是類絳色細胞（1.76%），粒細胞和漿細胞所占比例高達95.06%，根據齡翅目昆蟲血細胞的分類與功能，推測這2類血細胞可能也在小金蝠蛾幼蟲血淋巴的細胞免疫功能中發揮重要作用［13］。

2.2 小金蝠蛾幼蟲血細胞對病原真菌的免疫作用

分別統計了小金蝠蛾幼蟲感染病原菌后血細胞的總數變化和小金蝠蛾幼蟲體內注射病原菌后血細胞的免疫反應。圖2顯示小金蝠蛾幼蟲注射生理鹽水（RS）和冬蟲夏草菌（OS）以后，血細胞數量有一個先降低后回升，血細胞總數48 h內略比健康幼蟲多；但是感染粉棒束孢（IF）后，血細胞是先快速降低，然后略有回升，但是低于健康幼蟲的血細胞數量，最后持續下降的過程。因該研究采用的注射感染有微小創傷，在1 h略引起了血細胞的下降，可能與血細胞參與傷口的修復有關。從圖3可以看出，粉棒束孢感染刺激1 h后，可觀察到粉棒束孢被多層血細胞包被，形成結節，并發生黑化反應；冬蟲夏草菌侵染后，血細胞對冬蟲夏草菌未發生明顯的吞噬、結節等免疫反應，可能是因為血細胞的表面執行吞噬反應的偽足明顯減少或是模式識別蛋白無法識別［17-18］，但冬蟲夏草菌感染后存活的幼蟲，長時間觀察血細胞數量逐漸緩慢減少［3］。對于粉棒束孢，則可觀察明顯的結節和黑化現象，這可能是引起早期血細胞數量極速減少的原因之一［19］。粉棒束孢侵染的幼蟲的血淋巴體積略有變大，隨著體積的變化，可能導致細胞質的滲漏，免疫功能被破壞，導致幼蟲行動變化，隨著時間延長，粉棒束孢在體內增殖，血細胞破裂、減少，粉棒束孢子萌發菌絲，蟲體死亡。

2.3 小金蝠蛾幼蟲感染不同病原菌的生存曲線比較

為了觀察小金蝠蛾幼蟲對不同病原真菌感染的反應，每12 h記錄感染幼蟲的死亡數量，并繪制了各自的生存曲線，如圖4所示。因采用注射方式快速感染，微小的創傷可能引起少量幼蟲的死亡，但是在肉眼觀察中發現存活的冬蟲夏草菌感染的幼蟲，體表無任何病征表現，取食正常，與生理鹽水對照無顯著差異。粉棒束孢感染2～3 d后逐漸有病征表現，行動變緩，取食減少，有的幼蟲體表出現黑點或者黑斑，死亡逐漸增加，感染粉棒束孢7 d后小金蝠蛾幼蟲的生存率下降至41.28%，感染粉棒束孢幼蟲的體表特征與呂延華等［20］報道的一致。觀察粉棒束孢感染的死亡幼蟲的血淋巴發現，粉擬青霉致死的幼蟲體內血淋巴有萌發的粉棒束孢的菌絲。Log-Rank檢驗生理鹽水組幼蟲死亡頭數的觀察值為2，而粉棒束孢感染組的理論值為9.54，P值<0.01，表明粉棒束孢的死亡率遠遠大于生理鹽水組；而冬蟲夏草菌感染組幼蟲死亡頭數的理論值為1.86，P值>0.05，表明冬蟲夏草菌感染組的死亡率與生理鹽水組無顯著差異。

2.4 小金蝠蛾幼蟲酚氧化酶的活性變化

酚氧化酶又稱酪氨酸酶，主要參與昆蟲的調控細胞吞噬及黑化等免疫防御過程。酚氧化酶的活性常作為評價昆蟲免疫能力的指標。酚氧化酶在外源物的誘導下，通過酚氧化酶原級聯系統活化酚氧化酶。從圖5可以看出，在注射病原菌早期酚氧化酶的活性均上升，冬蟲夏草菌感染的幼蟲隨酚氧化酶活性下降，最后出現上下波動，波動幅度逐漸縮小至注射前的水平，12 h的快速上升可能與激活表達有關；粉棒束孢感染的幼蟲酚氧化酶活性緩慢波動下降后回升，一直處于較高的活力水平，推測幼蟲可能一直處于較強的免疫防御過程，病原真菌的感染是一個長時間的過程，早期酚氧化酶主要參與細胞介導的免疫防御，后期酚氧化酶調控體液免疫對菌絲的黑化作用［21］，因此推測粉棒束孢感染后，因無法被血細胞清理，而萌發出菌絲，可能激活了體液免疫的黑化作用。

3 討論

冬蟲夏草菌和粉棒束孢是蝙蝠蛾幼蟲的2種重要的病原真菌，但是二者感染蝙蝠蛾幼蟲后，發病的快慢存在顯著差異。在冬蟲夏草室內培殖過程中，通常將快速致死幼蟲的粉棒束孢病原菌列為主要病害之一。該研究從幼蟲細胞免疫入手，采用注射式的急性感染的方式觀察小金蝠蛾幼蟲血細胞對2種病原真菌的免疫響應差異和對小金蝠蛾幼蟲生存曲線的影響。結果發現血細胞可能無法識別冬蟲夏草菌，而未表現明顯的吞噬和結節等免疫反應，這可能與冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后，會引起血細胞表面偽足的變化，導致血細胞缺陷無法將冬蟲夏草菌識別為外源物［17］，冬蟲夏草菌的蟲菌體表面的光滑結構可能缺少被血細胞模式識別蛋白等結合的識別受體［3］。粉棒束孢感染小金蝠蛾幼蟲后，雖然可觀察到游離于血淋巴中的結節，可見被黑化的粉棒束孢有明顯的結節、包被、黑化等免疫響應，但是粉棒束孢感染與白僵菌感染家蠶相似，孢子仍可快速萌發為菌絲，充斥蟲體，甚至從氣孔等處長出菌絲，導致到期內幼蟲的致死［19］。雖然該研究觀察到了血細胞對不同病原菌的免疫防御差異，但是關于冬蟲夏草菌逃避血細胞的識別和粉棒束孢子黏附血細胞的機理還需要進一步研究。

4 結論

小金蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草菌的生存曲線無顯著差異，而小金蝠蛾幼蟲感染粉棒束孢的生存曲線具有顯著差異。冬蟲夏草菌感染初期，尚未觀察到血細胞對冬蟲夏草菌有明顯的吞噬、結節等免疫防御，酚氧化酶活性侵染初期出現降低，然后逐漸恢復至健康幼蟲水平，但是未發現黑化現象，冬蟲夏草菌在幼蟲體內以出芽形式繁殖。血細胞對粉棒束孢具有明顯的吞噬、結節和黑化等免疫響應，酚氧化酶活性初期降低后逐漸升高，但是不能阻礙粉棒束孢孢子萌發為菌絲，導致幼蟲的快速死亡。小金蝠蛾幼蟲對不同病原菌的免疫防御為后續研究冬蟲夏草菌侵染小金蝠蛾幼蟲后逃避免疫的作用機理奠定基礎。

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