基于網絡藥理學和實驗驗證探討頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的影響

張雙 李驍群 李江林 趙瑞珍 唐啟盛

〔摘要〕 目的 運用網絡藥理學方法探討頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的調控作用，并進行實驗驗證。方法 首先通過TCMSP、HERB數據庫查找頤腦解郁方組成藥物的主要活性成分，使用SwissTargetPrediction平臺進行靶點預測；利用GeneCards數據庫篩選抑郁癥、炎癥相關疾病基因；藥物與疾病靶點的交集靶點為頤腦解郁方的潛在調控靶點，在Cytoscape 3.8.0軟件中構建藥物-活性成分-潛在調控靶點-疾病網絡，應用CytoNCA插件計算度值，篩選重要的活性成分；利用STRING數據庫構建潛在調控靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡，得到核心蛋白，之后利用R語言對潛在調控靶點進行GO與KEGG富集分析，繪制條形圖和點圖。最終選取較重要的交集核心蛋白進行實驗驗證，動物實驗選用SPF級雄性大鼠，隨機分為正常組、模型組、頤腦解郁方組（中藥組）和鹽酸氟西汀組（西藥組），采用慢性不可預知溫和刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）聯合孤養法復制抑郁模型，使用曠場實驗評估大鼠的抑郁樣行為，最后采集各組大鼠的血清進行指標檢測。結果 共篩選出頤腦解郁方有效成分272種，作用靶點共計1167個，抑郁癥、炎癥相關靶點93個；頤腦解郁方的潛在調控靶點35個，較重要的活性成分為槲皮素和咖啡酸，核心蛋白為白介素-6（interleukin 6， IL-6）、干擾素（interferon， TNF）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）、白介素-1β（interleukin 1β， IL-1β）等，GO富集和KEGG富集分析結果顯示頤腦解郁方具有多靶點、多通路的特點，其中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）通路較為重要；動物實驗發現頤腦解郁方能夠降低抑郁大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平（P＜0.05）。結論 頤腦解郁方可能通過降低血清中促炎細胞因子水平發揮抗抑郁的作用，是多種成分、多種通路和靶點共同作用的結果。

〔關鍵詞〕 頤腦解郁方；抑郁癥；促炎細胞因子；網絡藥理學；實驗驗證;大鼠

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.014

Effects of Yinao Jieyu Formula on pro-inflammatory factors for depression based on

network pharmacology and experimental verification

ZHANG Shuang1，2， LI Xiaoqun1，2， LI Jianglin1，2， ZHAO Ruizhen2*， TANG Qisheng2

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Preventive and Treatment Center， The Third

Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of Yinao Jieyu Formula （YNJYF） on pro-inflammatory factors for depression based on network pharmacology and experimental verification. Methods The ingredients of YNJYF were obtained from TCMSP and HERB databases， and the targets were detected by SwissTargetPrediction. The genes related to depression and inflammation were obtained from GeneCards database. Intersection of ingredients and disease are the potential targets of YNJYF. The network of herbs， ingredients， potential targets and diseases was built by Cytoscape 3.8.0 software. And the degree was calculated by CytoNCA to find the important active ingredients. Then the protein-protein interaction （PPI） network about the potential targets through STRING database was constructed to obtain the core proteins， and the potential targets were analyzed by GO and KEGG with the R language， then the barplot and dotplot were drawn. Finally， the more important core proteins were selected to verify by experiment. SPF male rats were randomly divided into normal group， model group， YNJYF group （Chinese medicine group） and fluoxetine group （western medicine group）. Chronic unpredictable mild stress （CUMS） and solitary rearing were used to replicate the depression model， and the depressive-like behavior was evaluated by open field experiment. Finally， the serum of each group was collected for test. Results A total of 272 active ingredients and 1167 targets of YNJYF were obtained. There were 93 targets related to depression and inflammation， and 35 potential targets of YNJYF. The important active ingredients were quercetin and caffeic acid. The core proteins were interleukin-6 （IL-6）， interferon （TNF）， Toll-like receptors 4 （TLR4）， interleukin-1β （IL-1β）， etc. GO and KEGG enrichment analysis showed that YNJYF had multiple targets and multiple pathways， and nuclear factor kappa-B （NF-κB） pathway was more important. Animal experiment showed that YNJYF could reduce the levels of IL-6， TNF-α and IL-1β in depressed rats. Conclusion YNJYF may play an antidepressant role by decreasing the level of pro-inflammatory cytokines in serum， which results from the joint action of multiple components， multiple targets and multiple pathways.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yinao Jieyu Formula; depression; pro-inflammatory cytokine; network pharmacology; experimental verification; rats

隨著社會節奏的加快及競爭的加劇，抑郁癥成為現今社會最主要的情感障礙疾病[1]。抑郁癥以持續的情緒低落、快感缺失為主要表現，伴有不同程度的認知和行為改變，同時可伴有失眠、體質量改變等軀體癥狀以及幻覺、妄想等精神病性癥狀，甚至出現自殺行為，給家庭和社會帶來沉重負擔。目前，抑郁癥發病機制仍不明確，近年來，炎癥假說受到諸多關注且得到越來越多實驗證據的支持[2-3]。炎癥因子具有豐富的生物學特性，其可通過影響神經遞質的代謝、下丘腦-垂體-腎上腺軸等多種途徑參與抑郁癥的生理病理過程[4]。臨床研究表明，抑郁癥患者外周血中炎癥因子白介素-1β（interleukin 1β， IL-1β）、干擾素-α（interferon α， TNF-α）和白介素-6（interleukin 6， IL-6）水平明顯高于正常對照組，而在給予抗抑郁治療之后這些炎癥因子的表達水平得到抑制[5]。因此，炎癥細胞因子可能成為抑郁癥治療的新靶點。

頤腦解郁方是唐啟盛教授多年臨床經驗的總結，對治療抑郁癥具有良好的臨床療效，且安全性好[6-7]。前期基礎實驗結果表明頤腦解郁方可改善慢性不可預知溫和刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）模型大鼠抑郁樣表現[8-9]，可調控模型大鼠的神經遞質及信號因子的表達[8-10]。為進一步驗證其與免疫反應間的關聯，本研究采用網絡藥理學結合實驗驗證的方法觀察頤腦解郁方對抑郁癥炎癥細胞因子的影響，豐富中醫藥抗抑郁治療的科學理論和證據。

1 資料與方法

1.1 ?頤腦解郁方藥物活性成分和作用靶點的獲取

在中藥系統藥理學分析平臺[11]（ TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和本草組鑒平臺[12]（HERB， http：//drug.ac.cn/）分別搜索“刺五加”“五味子”“郁金”“梔子”化學成分。TCMSP篩選條件設置為生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18；HERB數據庫中藥物成分根據Lipinsk原則[13]在SwissADME數據庫中進行篩選。將上述獲得的中藥成分通過SwissTargetPrediction平臺預測靶點并導出。

1.2 ?抑郁癥和炎癥相關靶點的收集

以“depression”“depressive disorder”“major depressive disorder”和“inflammation”為檢索詞在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）檢索相關靶點導出并取交集。

1.3 ?藥物活性成分與疾病共同靶點篩選

應用R語言中的VennDiagram數據包對頤腦解郁方藥物活性成分靶點和抑郁癥、炎癥相關靶點進行篩選，獲得共同靶點，共同靶點認為是頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的潛在調控靶點。

1.4 ?構建藥物-活性成分-潛在調控靶點-疾病的數據網絡

在Cytoscape 3.8.0中構建頤腦解郁方藥物-活性成分-潛在調控靶點-疾病網絡，使用CytoNCA插件對網絡進行分析，根據Degree參數獲得頤腦解郁方在調控抑郁癥促炎細胞因子中發揮藥效的主要活性成分。

1.5 ?蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡

利用STRING數據庫構建頤腦解郁方調控抑郁癥促炎細胞因子水平的潛在調控靶點的PPI網絡，并篩選出核心蛋白。將潛在調控靶點錄入數據庫，物種選擇“homo sapiens”，最低閾值設置為中等置信度0.4，其余參數不變，隱藏沒有相互聯系的節點，獲得蛋白互作關系，導出PPI網絡，保存TSV格式文件，使用R軟件篩選核心蛋白。

1.6 ?潛在調控靶點的GO和KEGG通路富集分析

使用R語言的clusterProfiler及Bioconductor包[14]提供的GO通路和KEGG通路數據庫進行信號通路富集分析。以P＜0.05為條件進行信號通路富集分析，篩選出具有統計學意義的生物學過程和信號通路，并將富集結果可視化。

1.7 ?實驗驗證

1.7.1 ?實驗動物 ?SPF級雄性Wistar大鼠30只，體質量（200±10） g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證編號：SYXK（京）2020-0036。保持室內溫度、濕度固定，7：00～19：00光照（晝夜顛倒應激方法時段除外）。本研究由北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過，研究內容和過程涉及的實驗動物均符合國家對醫學實驗動物的有關要求，倫理編號為BUCM-4-2021091308-3166。

1.7.2 ?材料 ?（1）藥物：頤腦解郁方（藥物組成為刺五加20 g、郁金10 g、梔子10 g、五味子10 g，顆粒劑由北京康仁堂制藥有限公司提供，批號：20033601）；鹽酸氟西汀膠囊（規格：20 mg/粒，禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字J20170022）。

（2）試劑：放免試劑盒IL-1β（北京華英生物有限公司，批號：HY-100237）；TNF-α（北京華英生物有限公司，批號：HY-10116）；IL-6（北京華英生物有限公司，批號：HY-10105）。

（3）儀器：敞箱（自制，80 cm×80 cm×40 cm），夾尾器（自制），游泳水箱（自制，45 cm×33 cm×27 cm），恒溫加熱器（自制），空氣振蕩?。ü枮I東明醫療儀器廠，型號：HZQ-C），秒表計數器（上海晨光文具股份有限公司，型號：ARC925L8），SONY數碼攝錄一體機（日本索尼公司，型號：HDR-SR10E），單人單面潔凈工作臺（蘇潔凈化設備有限公司，型號：SW-CJ-ID）、電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：ME204），低溫離心機（日本Beckman，型號：Avanti JXN-30），γ-911全自動放免計數儀（中國科技大學實業總公司，型號：GC-911）。

1.7.3 ?方法 ?（1）分組：大鼠適應性喂養1周，按隨機數字表分為正常組、模型組、頤腦解郁方組（中藥組）、鹽酸氟西汀組（西藥組），共4組。

（2）造模：采用CUMS聯合孤養法制備抑郁大鼠模型[9]。CUMS方法：21 d內隨機選用以下7種應激方法：夾尾1 min、45 ℃熱環境5 min、晝夜顛倒、禁水24 h、禁食24 h、震蕩環境30 min、4 ℃冰水游泳5 min，每種方法使用3次，保證每周1次、隨機排序。孤養法：即大鼠單籠飼養。

（3）給藥方法：根據參考文獻于應激結束后開始干預，模型組、中藥組、西藥組開始分別灌胃雙蒸水、頤腦解郁方、鹽酸氟西汀[9-10]。頤腦解郁方顆粒和鹽酸氟西汀在灌胃前使用雙蒸水調配，濃度和灌胃劑量與課題組前期一致[10]，頤腦解郁方藥物濃度為0.62 g 生藥/mL，鹽酸氟西汀濃度為0.23 g/L。根據大鼠體質量變化調整灌胃量，灌胃量均為1 mL/100 g，連續灌胃28 d。正常組不予任何處理，正常自由飲水和進食。

（4）曠場實驗：使用自制黑色敞箱進行實驗，敞箱底面用白線劃分為25個16 cm×16 cm方格。將大鼠置于箱子中央方格中，觀察大鼠3 min的活動情況，記錄大鼠的水平運動得分和垂直運動得分。水平運動得分計分規則：以大鼠穿越方格數（至少3爪進入方格）為水平運動得分，每格得1分；垂直運動得分計分規則：以大鼠前兩肢直立次數為垂直運動得分，每直立1次得1分。每只測定結束后清理尿便并使用酒精消毒擦拭箱子內部，避免氣味殘留。

造模前、造模后和灌胃結束后，采用曠場實驗進行行為學測試，符合條件者進入下一步實驗過程。剔除死亡、衰弱、造模失敗以及合并其他系統病變的大鼠后， 最終每組納入6只進行實驗測試。

1.7.4 ?統計學方法 ?采用SPSS 26.0統計軟件進行處理，對所得數據資料進行分析，所有數據為計量資料，以“ｘ±s”表示。組間比較先進行數據的正態性和方差齊性檢驗，方差不齊采用秩和檢驗，符合條件者采用單因素方差分析檢驗（one-way Anova），組間比較采用LSD方法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ?頤腦解郁方活性成分和作用靶點

在TCMSP和HERB數據庫查找有效成分，通過篩選共獲得刺五加有效活性成分9個，五味子有效活性成分59個，郁金有效活性成分148個，梔子有效活性成分72個，去除重復的成分，得到頤腦解郁方有效活性成分共計272個。使用SwissTargetPrediction數據庫查找以上活性成分的靶點，篩選Probability＞0.05的靶點，刪除重復基因，共計1167個。

2.2 ?頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的潛在調控靶點

從GeneCards數據庫收集抑郁癥和炎癥相關基因，分別得到12 978個、11 109個靶點，納入Relevance score＞10的靶點，分別得到1552個、95個。使用R語言的VennDiagram數據包中Venny函數繪制藥物有效活性成分的作用靶點和抑郁癥靶點、炎癥靶點的交集，獲得頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的潛在調控靶點35個。詳見圖1。

2.3 ?藥物-活性成分-潛在調控靶點-疾病網絡

將郁金、梔子、刺五加、五味子的有效活性成分及潛在調控靶點導入軟件Cytoscape 3.8.0中，構建頤腦解郁方藥物-活性成分-潛在調控靶點-疾病的可視化網絡，如圖2所示。通過Cytoscape 3.8.0軟件中的CytoNCA插件計算網絡拓撲學特征，根據Degree進行排序，槲皮素（quercetin）和咖啡酸（caffeic acid）是Degree最高的藥物活性成分（Degree均為15，圖2紅色所示），其中槲皮素是刺五加、郁金、梔子3味藥的共有成分，咖啡酸是郁金、梔子的共同成分。

2.4 ?PPI網絡

在STRING網站的檢索框“Multiple proteins”輸入35個潛在調控靶點，物種選擇人類（Homo sapiens），得到頤腦解郁方對抑郁癥炎癥機制的潛在調控靶點的PPI網絡（圖3），該網絡共計35個節點，369條邊。

通過R語言分析獲取PPI網絡中關聯度最高的前20個核心蛋白，繪制條形圖（圖4），主要的核心蛋白有IL-6、TNF、TLR4、IL-1β等。

2.5 ?潛在調控靶點的富集分析

將35個潛在調控靶點基因導入R/bioconductor進行GO、KEGG富集分析。GO富集分析得到分子功能（molecular function， MF）條目18個，生物學過程（biological process， BP）條目769個，細胞組分（cellular component， CC）條目9個，選取結果的top20進行可視化分析，如圖5所示。其中MF主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、信號受體激活劑活性、抗氧化活性等；BP包括對各種刺激的反應（脂多糖、細菌來源分子）、對細胞黏附的調節、炎癥反應的調節、細胞因子生成的積極調節等；CC主要涉及質膜外側、分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔、囊泡腔等。

KEGG信號通路富集分析結果顯示P＜0.05的結果共有182條，通路主要集中在核因子κB（nuclearfactorkappa-B， NF-κB）信號通路、TNF信號通路、感染、白介素17（interleukin-17， IL-17）信號通路等，如圖6所示。

2.6 ?實驗驗證

2.6.1 ?各組大鼠曠場實驗結果比較 ?造模前各組大鼠曠場實驗水平運動得分和垂直運動得分差異無統計學意義（P＞0.05）。造模結束后，與正常組比較，各組大鼠曠場實驗水平運動得分和垂直運動得分均降低（P＜0.01，P＜0.05）。干預結束后，與模型組比較，中藥組和西藥組水平運動得分及垂直運動得分均上升（P＜0.05），結果見表1，圖7為各組大鼠曠場軌跡圖。

2.6.2 ?各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比較 ?與正常組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組和西藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均下降（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

抑郁癥屬于中醫學“郁證”范疇，《素問·舉痛論》曰：“百病生于氣也?！币钟舭Y也不例外，其基本病機為情志不舒、氣機郁滯[15]，加之現代社會快節奏和高壓力，造成精血津液等物質的消耗，如《靈樞·本神》記載：“怵惕思慮者，則傷神，神傷則恐懼流淫而不止……”頤腦解郁方以補腎調氣立意，其內涵為填腎精、益腎氣、溫腎陽、滋腎陰和調達氣機。腦為髓海，腎主骨生髓，神志的正常依賴腎精的充養以及氣的升降出入，正如《素問·六微旨大論》中所說：“出入廢，則神機化滅；升降息，則氣立孤危。故非出入，則無以生長壯老已；非升降，則無以生長化收藏?！比街赜么涛寮訛榫?，益腎填精、安神益智；五味子滋腎斂肺、寧心安神；郁金入肝經血分，可活血止痛、行氣解郁；梔子瀉火除煩，可解郁除煩；全方配伍應用，標本兼治，具有益腎降濁、理氣開郁、頤腦醒神的作用[3，16]。

研究表明，炎癥是抑郁癥等壓力相關性疾病的共同發病機制[17]，其發病和進展與免疫激活、促炎細胞因子分泌有關。因此，本研究采用網絡藥理學方法結合CUMS抑郁模型實驗驗證探討頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的調節作用。

藥物-活性成分-潛在調控靶點-疾病網絡表明頤腦解郁方中有效活性成分較多，而且某些活性成分會對多個目標靶點產生影響，體現了中藥多成分、多靶點、多通路的作用特點，其中槲皮素和咖啡酸是頤腦解郁方組成藥物中較為重要的活性物質。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于多種食物和中藥中，具有抗炎和抗氧化的作用[18]，研究發現，槲皮素能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β的激活發揮抗抑郁作用[19]?？Х人崾且环N存在于多種植物、藥材中的天然酚類物質，具有天然抗氧化、抗炎的作用，有研究顯示咖啡酸可改善CUMS模型大鼠的抑郁樣行為[20]，顯著降低抑郁大鼠海馬中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量[21]。

本研究結果顯示，頤腦解郁方對抑郁癥促炎細胞因子的潛在調控靶點共計35個，核心蛋白為IL-6、TNF、TLR4、IL-1β等。研究發現在抑郁癥患者中IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，而且其水平與抑郁癥的發展密切相關[5]。TLR4是一種模式識別受體，參與NF-κB信號通路激活，導致其下游IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的表達升高[22]。另外有研究發現，TNF-α會增加血腦屏障的通透性[23]，血腦屏障的功能障礙加速了炎癥介質和外周免疫細胞向中樞神經系統的滲透，導致行為異常和情緒障礙[24]。穿越血腦屏障的IL-6、IL-1β等促炎細胞因子能激活小膠質細胞，促進神經炎癥的發生[25]，介導海馬等腦區的細胞焦亡[26]，影響神經再生[27]，而且促炎細胞因子水平升高可引起大腦內吲哚胺-2，3-雙加氧酶升高，導致海馬組織內5-HT水平下降，從而誘發抑郁癥[28]。若能抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的過度產生、活化可能減輕腦神經損害的發生發展[11]。

GO分析結果顯示，這些靶點參與了細胞因子受體調節、細胞因子活性等過程，影響細胞因子的產生、轉運、信號傳遞等。KEGG富集分析結果顯示，核心靶點涉及NF-κB信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等多條通路，與炎癥反應密切相關。其中NF-κB信號通路是調節炎癥反應的重要通路，當阻斷NF-κB時，外周的炎癥反應則不會引起中樞炎癥反應。研究表明NF-κB可通過多種信號通路參與抑郁癥的發生，在CMS模型小鼠和LPS誘導的細胞模型中TLR4信號的激活促進了NF-κB的磷酸化，從而促進了炎癥反應，導致抑郁[29-30]。綜合網絡藥理學和動物實驗結果認為，頤腦解郁方可能通過槲皮素、咖啡酸等有效活性成分抑制NF-κB信號通路，從而降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，使5-HT神經遞質水平恢復正常從而產生抗抑郁作用，頤腦解郁方還可能通過降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平減輕神經炎癥，產生神經保護作用。

動物實驗研究結果顯示，21 d CUMS應激結束后，和正常組相比，其余3組大鼠曠場實驗水平運動得分、垂直運動得分偏低，提示模型制備成功。藥物干預28 d后，與模型組相比，中藥組和西藥組曠場實驗水平運動得分、垂直運動得分上升，說明頤腦解郁方同鹽酸氟西汀一樣，可改善抑郁大鼠行為，提示頤腦解郁方具有抗抑郁作用。模型組與正常組相比，血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.01），說明促炎細胞因子升高與抑郁癥相關；中藥組和西藥組促炎細胞因子水平較模型組下降，表明頤腦解郁方能夠降低CUMS抑郁模型大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α促炎細胞因子水平。

綜上所述，本研究從網絡藥理學角度對頤腦解郁方調控抑郁癥促炎細胞因子的有效活性成分、潛在調控靶點、關鍵蛋白和通路、機制進行了闡述，并針對血清促炎細胞因子水平進行了實驗驗證。結果提示頤腦解郁方可能通過降低血清促炎細胞因子水平從而改善抑郁癥，其作用涉及不同靶點和通路，體現了中醫藥治療抑郁癥的多靶點、多途徑的治療特點。本次研究為初步探索，頤腦解郁方調節抑郁癥促炎細胞因子水平的具體通路機制需進一步實驗驗證。

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〔收稿日期〕2022-10-27

〔基金項目〕中央高?；究蒲袠I務費專項重點攻關項目（2020-JYB-ZDGG-144-3）。

〔第一作者〕張 ?雙，女，博士研究生，研究方向：神經精神疾病的中醫藥防治。

〔通信作者〕*趙瑞珍，女，博士，主任醫師，碩士研究生導師，E-mail：zhaoruizhen2009@163.com。