地方小麥品種貴協3號赤霉病抗性QTL的定位與效應鑒定

鄭首航,何員江 ,陶 軍 ,張 華,吳 舸,鄒鳳亮 ,杜小英,歐俊梅,雷加容 ,閆海生,賈海燕,任 勇

(1.綿陽市農業科學研究院,四川綿陽,621000; 2.南京農業大學農學院,江蘇南京,210095)

由鐮刀菌引起的赤霉病對小麥生產危害嚴重,可導致小麥產量和品質下降[1]。近年來,由于全球氣候變暖、免耕技術的推廣以及秸稈還田等原因,國內外小麥赤霉病的發生和流行程度日趨嚴重,引起國際廣泛關注[2]。該病在中國常年發生面積在267萬～333萬hm2,且有逐漸擴大的趨勢[3],流行區域由傳統的長江中下游、黃淮麥區向華北麥區蔓延。由于赤霉病抗性受環境影響大以及抗病機制復雜,致使小麥抗赤霉病育種進展緩慢,目前大面積推廣的品種赤霉病抗性普遍較差[4]。在已發現的赤霉病抗源中,僅有中國地方品種望水白和蘇麥3號表現較為突出[5]。挖掘抗病基因,解析分子機制以及培育抗赤霉病小麥品種,是小麥抗赤霉病育種工作的重中之重。

小麥在受到赤霉病病原菌侵染后,會產生一系列復雜的信號途徑激活應答反應,誘導抗病相關基因的表達,進而引起蛋白以及代謝水平的變化,抵御病原菌的侵襲。小麥對赤霉病的抗性包括抗侵入(Type Ⅰ)、抗擴展(Type Ⅱ)、抗毒素積累(Type Ⅲ)、降低病粒率(Type Ⅳ)和耐病性(Type Ⅴ)五種類型[6],是受多基因控制的數量性狀。隨著小麥基因組學的發展,借助DNA分子標記和遺傳圖譜,已定位到400多個抗赤霉病基因/QTLs[7],分布在小麥21條染色體上,這些基因/QTLs主要來自蘇麥3號及其衍生系和望水白[7-8],其中Fhb1～Fhb7已被精細定位[9-16]。前人在CM82036[17]、DH181[18]、W14[19]、周麥27[20]等品種中均鑒定到Fhb5基因,是目前抗性最強、最穩定的抗侵入相關基因[21]。

貴協3號是貴州省農業科學院旱糧研究所2008年用以色列野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)為母本,用光稃野燕麥 (AvenafatuaL.var.glabratapat)為父本進行遠緣雜交,獲得的F1代與貴農22回交獲得的普通小麥材料。2013年,經國家小麥產業技術體系在江蘇海安、南京和湖北武漢三地的赤霉病抗性鑒定中,貴協3號表現為中抗至抗病,2014年在海安試驗點也表現出較好的抗性,病情指數低于抗病對照品種蘇麥3號[22],但目前尚未有貴協3號抗赤霉病QTL的定位報道。本研究以感赤霉病品種綿麥96-5和貴協3號構建的含有196個株系的DH群體為材料,結合兩年兩個地區的赤霉病嚴重度數據,挖掘與赤霉病抗性相關的QTL,并分析其聚合效應,以期了解貴協3號抗赤霉病的遺傳基礎,為小麥抗赤霉病育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 供試材料及田間種植

試驗材料為貴協3號和綿麥96-5及其雜交F1代通過花藥培養、染色體加倍獲得的含有196個株系的DH群體。貴協3號由貴州省農業科學院旱糧研究所提供,綿陽96-5為四川省綿陽市農業科學研究所自育品系。

于2018和2019年將DH群體及其親本分別種植在南京農業大學試驗基地和四川省綿陽市農業科學研究院試驗田(分別用2018NJ、2019MY表示),進行赤霉病抗侵入表型鑒定,以貴協3號和綿麥96-5分別作為抗、感病對照。四種強致病菌種F15、F301、F7136以及GFP標記過的菌株WT-GFP由南京農業大學應用基因組實驗室提供。

采用隨機區組試驗設計,每三行設置一空行,每個株系2個重復,行寬1.5 m,行距0.3 m,每行播種25粒。

1.2 田間接種及抗性鑒定

將小麥籽粒在清水中浸泡過夜,在沸水中煮30 min,晾干表面水分后分裝至500 mL組培瓶中,121 ℃滅菌30 min后,于烘箱中烘干3～5 min,即為麥粒培養基。將四種強致病菌種F15、F301、F7136以及GFP標記過的菌株WT-GFP接種在麥粒培養基中,室溫培養10 d左右,待培養基表面布滿白色菌絲后,于開花前4 d在田間進行撒播,撒播小麥病麥粒后,盡量保持濕潤,于開花后10 d進行抗性表型鑒定,調查病小穗數和總小穗數,每個株系調查20個穗,嚴重度計算采用下面公式:嚴重度(%)=病小穗數/總小穗×100%[21],取平均值記為株系的嚴重度。3次重復。鑒定圃周圍試驗田未進行其他菌株和其他病原菌接種。

1.3 統計分析

根據赤霉病嚴重度,將DH群體的196個株系分為三種不同的表型:抗病親本類型(嚴重度在10%以下)、感病親本類型(嚴重度在10%～50%之間)和不同于親本的其他類型(嚴重度在50%以上)[23]。

1.4 基因型分型、連鎖圖譜的構建和QTL分析

采用SPSS Statistics 17.0對表型數據進行t檢驗、相關性分析等。用CTAB法[24]提取DH群體及親本的DNA,用澳大利亞基因芯片公司的55K DArT標記基因芯片雜交技術平臺對196個DH株系及親本進行全基因組掃描,利用QTL IciMapping V4.1軟件的BIN功能對冗余標記進行刪除,篩選出兩親本間存在多態性的標記,并進行連鎖圖譜的構建,利用完備區間作圖法(ICIM)對QTL進行定位分析;通過軟件的1000 permutation功能計算LOD閾值,P值設定為0.05,檢測QTL的顯著性。與中國春最新參考基因組(IWGSC RefSeq v1.0)進行比對,獲得標記的物理位置。

2 結果與分析

2.1 DH群體的赤霉病嚴重度鑒定結果

感病親本綿麥96-5在2018年江蘇南京和2019年四川綿陽試驗基地的赤霉病平均嚴重度為36%和53%,而抗病親本貴協3號的平均嚴重度為13%和20%,DH群體的平均嚴重度為5%～93%,該群體后代株系的嚴重度均呈現連續性變異(圖1),分布頻率基本符合正態分布,表明該群體的赤霉病嚴重度屬于數量性狀,由多個基因控制。根據孟德爾遺傳分析法和數量性狀分析法,估算該群體至少含有2～4個抗侵入基因/QTLs(表1和表2)。

2018NJ:2018年南京;2019MY:2019年綿陽。表1～3同。1、2和3為3個重復。表1同。2018NJ:Naijing of 2018; 2019MY:Mianyang of 2019. The same in tables 1～3. 1,2 and 3 were three replicates. The same in table 1.圖1 DH群體赤霉病嚴重度的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of FHB severity in DH population

表1 孟德爾遺傳分析法估算DH群體中含有的抗赤霉病基因數目Table 1 Number of FHB resistant genes in DH population evaluated by Mendelian genetic analysis method

表2 數量性狀分析法估算DH群體中含有的抗赤霉病基因數目Table 2 Number of FHB resistance genes in DH population by quantitative genetic analysis method

2.2 遺傳連鎖圖譜的構建

利用覆蓋小麥21條染色體的大約373 60個標記的DArT-Seq芯片對親本及196個株系進行基因分型,結果發現有13 472個DArT-Seq標記位點(占標記總數的36%)在親本間具有多態性。利用QTL IciMapping V4.1軟件的BIN功能,對冗余標記進行刪除,最終獲得1 432個DArT-Seq標記。這些標記構成的遺傳連鎖圖譜覆蓋小麥全基因組,圖譜全長為15 195.8 cM,平均圖距為10.6 cM。

2.3 抗赤霉病QTL的定位結果

共檢測到3個抗赤霉病QTLs,其中QTL-FHB.GX-2B在2B染色體上,與AX-111081804標記緊密連鎖;QTL-FHB.GX-5B在5B染色體上,與AX-111012188標記緊密連鎖;QTL-FHB.GX-7A在7A染色體上,位于標記AX-110915586 ～AX-108934756之間,區間長度為16 cM (圖2)。這3個QTLs的抗性等位基因均來自于抗病親本貴協3號,LOD值分別為12.7、8.5和10.6,分別可解釋1.5%、1.2%和1.3%的表型變異;這3個抗赤雷病QTLs在2018南京和2019綿陽兩個環境下均能檢測到,抗性表現較為穩定。

圖2 抗赤霉病QTL在染色體上的分布Fig. 2 Distribution of QTLs for resistance to FHB on chromosomes of wheat

2.4 QTL的加性互作效應

利用與3個QTL緊密連鎖的分子標記的基因型數據,分析其累加效應,結果在196個株系中共發現8種抗赤霉病單倍型(表3)。其中,32個株系含有3個抗赤霉病QTL,2018南京和2019綿陽兩個環境的平均嚴重度分別為24%和30% (表3);72個株系含有2個抗赤霉病QTL,2018南京和2019綿陽兩個環境的平均嚴重度分別為26%～31% 和36%～41%;68個株系只含有1個QTL,2018南京和2019綿陽兩個環境的平均嚴重度分別為27%～32%和39%～46%;24個株系不含有檢測到的抗赤霉病QTL,2018南京和2019綿陽兩個環境的年平均嚴重度分別為33%和50%。這說明含有多個抗赤霉病QTL株系的赤霉病嚴重度明顯低于含有單個和不含抗赤霉病QTL的株系。

表3 QTL組合對赤霉病嚴重度的影響Table 3 Effect of QTL combinations to FHB severity

3 討論

本研究利用數量性狀分析法以及孟德爾遺傳分析法,預測到 DH群體(貴協3號×綿麥96-5)的抗赤霉病性狀受3～4個加性基因控制,進一步利用QTL IciMappingV4.1軟件共定位到3個抗赤霉病QTL,與數量性狀分析法估算群體中的基因數目基本一致。本研究在7A染色體上定位到的QTL-FHB.GX-7A(物理區間為15 681 840～91 358 341 bp),與Zhang等[25]在7A染色體上定位到的QTL(區間為21 763 191～33 614 065 bp)區間存在部分重疊,但尚不能確定是否為同一個基因。本研究定位到的3個QTL的抗性等位基因均來自于抗病親本貴協3號,表型變異解釋率為1.2%～1.5%,推測貴協3號的赤霉病抗性是多個微效基因的累加效應,后續將會采取相關試驗進行進一步的驗證。本研究同時也進一步證明,以色列野生二粒小麥與光稃野燕麥遠緣雜交獲得的貴協3號,對小麥赤霉病具有良好的抗性。在目前我國赤霉病危害不斷蔓延的情況下,貴協3號可作為抗病資源在小麥抗病育種中加以利用。

在小麥抗赤霉病研究中,經國內外科學家的不懈努力,已經取得了長足的進展。如抗赤霉病基因Fhb1在美國、日本以及我國江蘇等地區均已得到成功應用;抗性資源蘇麥3號和望水白抗赤霉病位點的有利等位變異,也已進行了分子標記輔助選擇聚合育種[26]。近幾年我國不斷加強對赤霉病的防控工作,已經培育出一批達到抗或中抗赤霉病的小麥新品種。但由于全球氣溫變暖和種植制度的不斷改變,小麥赤霉病在我國已經從長江中下游、黃淮麥區擴展到全國各大麥區,加強小麥抗赤霉病的研究以及抗赤霉病新品種的選育任重而道遠。