微流控下“水包水”明膠亞微米粒的制備

呂 卉, 劉 孟, 肖新才

(中南民族大學藥學院, 武漢 430074)

在藥劑學上, 微米粒(microspheres, MS)給藥指的是一種藥物分子包裹于高分子材料的聚合物當中, 從而實現藥物長時間穩定釋放的緩控釋藥物傳遞系統. 常用的微米粒制備方式有攪拌法、乳化溶劑萃取法、相分離法、膜乳化法等[1-6], 以及微流控制備法. 在傳統的制備方式中, 攪拌法得到的微米粒粒徑分布不均, 相分離法、乳化溶劑萃取法等實驗條件嚴格、操作繁瑣、成本偏高[7]. 微流控技術相較于傳統的技術工藝, 具有成本低、能耗低、操作簡便、響應速度快等優點, 如今微流控技術被廣泛應用于生產和生活的多個領域[8-11].

一般情況下, 當輸入液體壓力一定的情況下, 液體在管道內流動時, 如果管道橫截面積變小, 流速也會相應增加, 因而產生剪切力[12]. 微流控裝置就是利用第二相流速增加所產生的剪切力, 切斷從針頭流出的第一相液體, 第一相以微米粒的方式包裹在第二相液體中, 形成粒徑可控、單分散性好的水包水、油包水或其他各種形式的微米粒[13]. 所謂“水包水”微米法是一種水溶性聚合物分散到另一種互不相溶的水溶性介質中形成的微米粒, 因而其最大特點就是在制備過程中避免了使用有毒性的有機試劑, 使微亞微米粒的生產制備及使用過程更加安全、環保[14-16].

明膠, 是天然高分子的親水性物質, 具有無毒無害, 來源豐富, 生物可降解的特點, 同時明膠的來源廣泛, 價格較為低廉, 因此是控釋劑的理想載體, 擁有良好的應用前景[1,17-20]. 明膠不溶于乙醇, 也會與甲醛形成不溶于水的不可逆凝膠, 這為采用微流控設備制備“水包水”式微米明膠提供了可能[17]. 本實驗中采用的是微流控裝置, 利用了“水包水”離子凝膠化法制備明膠微米?；蛘邅單⒚琢? 實驗中第一相采用的明膠溶液, 第二相采用無水乙醇進行剪切, 最后收集產物后再使用甲醛進行固化[17]. 研究內容包括探討第一相液體質量濃度、第一相針頭伸入第二相針頭的距離、明膠亞微米粒測量時間對粒徑大小的影響、以及明膠亞微米粒固化方式對成品的影響. 期望實驗數據為定量制備單分散納米明膠粒提供支持.

1 實驗部分

1.1 主要原料

明膠(gelatin): CP, 阿拉丁;甲醛, 水溶液(HCOH): AR, 上海國藥;乙酸(CH3COOH): AR, 上海國藥;無水乙醇(CH3CH2OH): AR, 上海國藥.

1.2 明膠溶液的制備

在250 mL燒杯中, 將1 g明膠溶于100 g水中, 在40 ℃下攪拌24 h, 將所得溶液進行低壓抽濾, 即得到實驗所需的質量分數為1%明膠溶液. 調整溶于水中明膠的質量, 得到不同質量分數的明膠溶液.

1.3 明膠亞微米粒的制備

組裝微流控裝置, 第一相針采用30號針頭(長度:50.8 mm, 外徑:0.32 mm, 內徑:0.14 mm, 端頭內徑:3.86 mm), 第二相針采用23號針頭(長度:36.6 mm, 外徑:0.63 mm, 內徑:0.37 mm, 端頭內徑:3.86 mm). 在微流控裝置中, 第一相液體采用明膠溶液, 第二相液體采用無水乙醇, 用注射器吸取兩相液體, 注射器與第一相和第二相的液體輸液管連接, 將注射器置于注射泵上, 設定好兩臺注射泵的參數, 使注射泵將兩相液體固定的流速先后通入微流控裝置中. 打開加熱裝置和蠕動泵, 使與微流控裝置相連的冷凝管溫度達到40 ℃(明膠溶液在常溫下為固態, 40 ℃下為液態, 在實驗過程當中需要盡可能使反應物以及產物保持在40 ℃). 再取一個潔凈的100 mL空燒杯, 放置于40 ℃的恒溫水浴鍋中, 持續攪拌, 用于收集微流控裝置擠出的明膠亞微米粒. 調整不同的條件, 如第一相的流速、第一相針頭伸入第二相針頭的距離、明膠亞微米粒的測量時間、明膠亞微米粒的固化方式、產物的處理方式等, 探索不同條件對明膠亞微米粒粒徑的影響.

制得的明膠亞微米粒溶液中, 加入合適量的乙酸溶液用于調節溶液的pH值, 使溶液的pH值在4左右, 然后冷卻溶液至室溫. 在通風櫥中, 冰浴條件下向溶液中緩慢滴加2 mL甲醛溶液, 溶液溫度保持在0～5 ℃, 繼續攪拌30 min, 室溫下放置2 h 后, 得到固化后的明膠粒溶液.

1.4 正交實驗的設計

根據實驗制備方式, 選擇明膠溶液質量分數(A)與第二相針頭伸入第一相針頭的距離(B)作為實驗的考察因素, 每個因素設置5個水平進行正交實驗, 正交實驗設計表如表1、表2.

表1 明膠亞微米粒制備實驗因素水平表

表2 明膠亞微米粒制備條件篩選方案

1.5 明膠亞微米粒的表征

取1.3中得到的固化后的明膠亞微米粒溶液200 μL, 加入1 800 μL的純化水稀釋明膠溶液, 用馬爾文粒度儀(Nano ZSE, 上海思百吉儀器系統有限公司)測定稀釋后的明膠亞微米粒的水力學半徑.

取1.3中得到的固化后的明膠亞微米粒溶液, 在透射電子顯微鏡(TEM, TALOS F200X, Thermo Fisher Scientific)下觀察明膠亞微米粒的表面形貌.

單分散性指數(polymer dispersity index, PDI)是用來表征聚合物粒徑分散性指數, 計算公式如下:

(1)

其中,D90、D50和D10分別為微粒累積分布曲線中質量分數分別為90%、50%和10%時對應的顆粒直徑.PDI值越小, 顆粒單分散性越好;反之則變差. 當PDI< 0.4時, 認為微球單分散性好[21]．

2 結果與分析

2.1 第一相明膠溶液的質量分數的影響

圖2為明膠溶液質量分數與明膠亞微米粒粒徑大小的關系. 在第一相流速固定為1 μL·min-1、第二相流速固定為350 μL·min-1、第一相針頭伸入第二相針頭的距離為7.5 mm等條件不變的情況下, 在一定范圍內改變明膠溶液質量分數(如1%～3%), 即表2中實驗1～5, 質量分數的改變對明膠粒徑的影響不大, 且在質量分數為2%時, 單分散性指數最小且小于0.4, 說明此時明膠粒徑分布較為均勻;當質量分數高于3%時, 測得明膠粒徑數據較差, 此時明膠溶液更容易凝固并堵塞微流控裝置, 故實驗中不采用較大濃度的明膠溶液[22]. 而當質量分數小到0.5%時, 明膠粒徑變大,PDI也較大, 說明此時明膠粒的單分散性差, 明膠粒徑分布不均, 其原因可能是此時的明膠量不足以形成亞微米?；騺單⒚啄?

圖2 明膠亞微米粒粒徑與明膠溶液濃度的關系Fig.2 Relationship between size of gelatin submicrospheres and concentration of gelatin solution

2.2 第一相針頭伸入第二相針頭距離的影響

圖3為微流控裝置內第一相針頭伸入第二相針頭(其距離為L)的示意圖. 圖4為第一相針頭伸入第二相針頭的距離與明膠亞微米粒的關系. 在第一相流速固定為1 μL·min-1、第二相流速固定為350 μL·min-1、明膠溶液質量分數分別為1%和2%的情況下, 明膠粒徑大小隨著L的改變有明顯的變化, 即表2中實驗6～15, 當L為7.5 mm時, 第二相液體從腔內進入針頭, 液體流動時的橫截面積改變最大, 液體的瞬時流速改變最大, 因而產生的剪切力最大, 此時明膠粒徑最小. 而隨著L的增加, 得到的明膠粒粒徑和單分散性都隨之增加, 這是因為伸入針頭越長, 第二相流體的流場越發軸向, 剪切力越弱, 得到的亞微米粒尺寸越大[23]. 明膠溶液的質量分數不同,L對明膠亞微米粒粒徑的影響也不完全相同, 再次證明小濃度的明膠溶液在亞微米?；蛘邅單⒚啄倚纬蛇^程中, 不容易成型.

圖3 微流控裝置內第一相針頭伸入第二相針頭的示意圖Fig.3 Schematic diagram of the distance of the first phase needle extending into the second phase needle in the microfluidic

圖4 第一相針頭伸入第二相針頭的距離與明膠亞微米粒的關系Fig.4 Relationship between the distance of the first phase needle and the second phase needle and gelatin submicrospheres

2.3 明膠粒測量時間對粒徑大小的影響

表3為明膠粒測量時間與明膠粒徑的關系. 由測量數據可得, 24 h后測得的明膠粒粒徑數據比2 h后測得的明膠粒粒徑偏大. 這是因為明膠粒在水溶液浸泡過程中容易溶脹.

表3 明膠粒測量時間與明膠粒粒徑的關系

2.4 明膠亞微米粒固化方式的影響

表4為明膠粒粒徑與明膠固化方式的關系. 在明膠溶液質量分數為1%、第一相流速固定為1 μL·min-1、第二相流速固定為350 μL·min-1、第一相針頭伸入第二相針頭的距離等條件不變的情況下, 改變固化的處理方式發現, 在燒杯中直接加甲醛溶液, 使產物滴入燒杯中直接固化方式得到的明膠亞微米粒粒徑, 比收集產物后再加入甲醛溶液的固化方式所得到的明膠粒徑較小, 但是產物滴入直接固化方式得到的明膠粒觀察發現, 其粒徑分布不均勻, 粒徑差值較大, 可能因部分明膠未成球為小粒徑顆粒, 部分明膠團聚成為大粒徑物質.

表4 明膠粒粒徑與固化方式的關系

2.5 對產物采用不同的處理方式的影響

在明膠溶液質量分數為1%、第一相流速固定為1 μL·min-1、第二相流速固定為350 μL·min-1、第一相針頭伸入第二相針頭的距離等條件不變的情況下, 本次實驗以改變對明膠亞微米粒的處理方式, 來探求是否有使得明膠亞微米粒粒徑不變的情況下, 除去明膠亞微米粒溶液中的有機溶劑的最優處理方式. 表5是對產物的不同處理方式與明膠亞微米粒粒徑的關系. 由上述表可知, 通過不同的處理手段, 可知222.2 nm的亞微米粒在經過純化水洗處理后得到的亞微米粒分布不均, 抽濾處理后可以得到粒徑分布較為均勻的數據, 但明膠粒粒徑較大, 與原樣差值較大, 故兩種方式均不能采用.收集時攪拌與不攪拌兩種方式明膠粒粒徑大小接近, 但收集產物時不攪拌的產物PDI較大于收集產物時攪拌, 固收集產物時, 收集產物時攪拌不會對明膠粒的形貌有較大的影響, 收集產物時不攪拌明膠粒會有一部分團聚.

表5 不同處理方式對明膠粒粒徑的影響

2.6 優化實驗的測量結果

通過以上的實驗, 最后選取了質量分數為2%的明膠溶液, 控制微流控裝置的第一相流速固定為1 μL·min-1、第二相流速固定為350 μL·min-1, 第一相針頭伸入第二相針頭的距離為7.5 mm等的實驗條件制備明膠粒, 接取明膠粒溶液后, 再加入乙酸及甲醛溶液進行固化, 采用后固化的方式.在制備明膠亞微米粒的2 h后對固化后明膠粒溶液原樣進行測量, 觀測明膠粒的形貌.

圖5制備得到的明膠粒溶液取200 μL, 加入1 800 μL純化水稀釋, 取稀釋后的明膠粒溶液1 mL于馬爾文粒度儀的塑料樣品池中, 放入馬爾文粒度儀中檢測得到的明膠粒水力學半徑. 從圖中可得, 在以上實驗條件下制備的明膠粒平均粒徑為164.6 nm,PDI為0.155, 此時明膠粒粒徑較小, 單分散性較好.

圖5 明膠亞微米粒的水力學直徑Fig.5 Hydraulic diameter of gelatin submicrospheres

圖6為制備得到的明膠亞微米粒溶液原樣在透射電子顯微鏡下得到的明膠亞微米粒的透射電子顯微鏡圖. 圖中顯示制備的明膠亞微米粒粒徑分布較為均一, 粒徑約為145.2 nm, 考慮水力學作用, 結果與水力學直徑相符．

圖6 明膠亞微米粒的TEM圖Fig.6 TEM diagram of gelatin submicrospheres

3 結語

本實驗是通過改變不同的實驗條件, 明膠溶液的質量分數、第一相針頭伸入第二相針頭的距離等, 以期找到一個最優的實驗條件, 從而得到粒徑較小, 分布較為均勻的明膠亞微米粒. 通過以上的實驗可以發現, 當明膠溶液質量分數為2%, 第一相針頭伸入第二相針頭的距離為7.5 mm, 接取明膠亞微米粒溶液后固化, 直接測量產物固化后原樣, 在制樣的2 h后測樣時, 可以得到粒徑較小, 單分散性較好的明膠亞微米粒. 在以上的實驗條件下制備明膠粒, 結果顯示此條件下得到的明膠粒粒徑較小, 單分散性較好, 分布均勻, 是制備明膠亞微米粒較為良好的實驗條件.