水楊酸鈉增強氧化應激介導耳蝸螺旋神經節神經元損傷作用的實驗觀察

祝小婷, 黃佳琳, 林曉宇, 蘇紀平

水楊酸是阿司匹林的活性成分,具有解熱鎮痛、抗炎等多種功效,是目前全球應用最廣泛的非甾體類藥物之一。然而,在水楊酸類藥物使用過程中常伴隨著不少的副作用,尤以耳毒性最為常見,主要表現為耳鳴和聽力下降[1]。耳蝸螺旋神經節神經元(spiral ganglion neurons,SGN)是連接毛細胞與聽覺中樞的重要樞紐,已被證實是水楊酸鈉(sodium salicylate,SS)耳毒性的重要作用位點[2],但其具體作用機制仍未完全明了。氧化應激是耳聾的常見損傷機制,在噪聲性聾[3]、老年性聾[4]以及順鉑誘導的耳毒性聾[5]中均可觀察到氧化應激增強。有研究顯示SS對神經元的氧化應激損傷具有保護作用[6-7]。但亦有研究發現SS會增強氧化應激,誘導細胞凋亡[8]。本課題組既往研究發現,SS使SGN中過氧化物陰離子[活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)來源之一]水平升高[9],提示SS可能通過增強氧化應激導致SGN損傷。本研究旨在通過免疫熒光技術觀察SS對新生SD大鼠耳蝸SGN的影響,定位ROS產生的位置并量化其表達水平,為進一步研究SS致SGN損傷的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取新生2～3 d齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級SD大鼠21只,雌雄不限,由廣西醫科大學實驗動物中心提供。耳蝸器官培養組6只,SGN原代培養組15只。其中耳蝸器官培養組隨機分為對照組和5 mM SS組,每組3只。SGN原代培養組隨機分為對照組、5 mM SS組、5 mM SS+N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)組、陽性對照過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)組、H2O2+NAC組,每組3只。

1.2主要儀器及試劑 主要儀器:細胞恒溫培養箱(ThermoFisher公司),倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)。主要試劑:10×多聚賴氨酸和100×青鏈霉素混合液購自索萊寶公司;DMEM-F12(1∶1)培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)購自Gibco公司;SS、4%多聚甲醛、Tritonx-100、山羊血清、H2O2購自Sigma公司;NAC購自阿拉丁公司;鼠抗βⅢ-Tubulin購自Abcam公司;Alexa-8890S標記山羊抗鼠IgG熒光二抗購自美國CST公司;CCK8檢測試劑購自東仁化學科技有限公司;活性氧檢測試劑盒購自碧云天公司;貼壁得購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 SGN原代培養及SS干預方法 SD大鼠經75%酒精消毒后斷頭處死,對半剪開頭顱并剔除腦組織后放于4 ℃ PBS中,在解剖顯微鏡下分離出完整的耳蝸,剔除螺旋韌帶和基底膜,留取完整的蝸軸(即SGN所在部位),將其用胰蛋白酶消化10 min,離心、重懸后種植在用多聚賴氨酸包被過的培養皿上,將種植好的細胞放在細胞恒溫培養箱中進行培養。用含胎牛血清及青鏈霉素混合液的培養基培養24 h后進行半換液,繼續培養24 h后進行藥物干預。SS處理組用含5 mM SS的培養基進行培養,SS+NAC組用含100 μM NAC培養基預處理1 h后再用含5 mM SS和100 μM NAC的混合培養基進行培養,H2O2組用含300 μM H2O2培養基進行培養,H2O2+NAC組用含100 μM NAC培養基預處理1 h后再加用含300 μM H2O2和100 μM NAC的混合培養基進行培養。

1.3.2 耳蝸器官處理及培養 SD大鼠經75%酒精消毒后斷頭處死,對半剪開頭顱并剔除腦組織后放于4 ℃ PBS中,在解剖顯微鏡下沿耳蝸縱軸剝開蝸殼,仔細分離螺旋韌帶,將含有Corti器及SGN的中回組織取出,平鋪在事先用貼壁得孵育過的培養皿上,用含胎牛血清及青鏈霉素混合液的培養基培養。

1.3.3 SGN中氧化應激水平檢測 SGN加藥處理后,移除培養基,用DMEM-F12無血清培養基洗滌1次。加入ROS熒光探針DCFH-DA,在37 ℃培養箱中避光孵育20 min,移除熒光探針,用DMEM-F12洗滌3次(5 min/次),加入4%多聚甲醛固定30 min,移除固定液,用PBS洗滌3次(15 min/次)。將培養物放入神經元標志βⅢ-Tubulin一抗溶液(含1% Tritonx-100+5%山羊血清)中,4 ℃孵育過夜。移除一抗溶液,用PBS洗滌3次(15 min/次),滴加Alexa-8890S標記山羊抗鼠IgG熒光二抗溶液(含1%Tritonx-100+5%山羊血清),室溫避光孵育2 h。移除二抗溶液,用PBS洗滌3次(15 min/次)。滴加抗熒光淬滅劑,封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照,使用Image J軟件對熒光強度進行量化分析。

1.3.4 CCK8法檢測SGN細胞存活率 取原代培養SGN細胞接種于96孔板中,加藥處理48 h后移除藥物溶液。各孔加入100 μl DMEM-F12培養基后再加入10 μl CCK8反應溶液,繼續孵育3 h。在酶標儀下檢測各孔450 nm波長處的吸光度(optical density,OD)值。實驗同時設置空白組(加入等體積的DMEM-F12培養基及CCK8反應溶液,不含細胞)。每組設置4個復孔,重復4次實驗。細胞存活率(%)=[(處理組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

2 結果

2.1SS與SGN氧化應激水平 對于耳蝸器官培養SGN對照組和5 mM SS組,采用神經元標志物βⅢ-Tubulin標記SGN,SGN胞體和軸突均可見明顯的紅色熒光;ROS熒光探針DCFH-DA呈現綠色熒光,與對照組相比,經5 mM SS干預48 h后ROS熒光在SGN處升高,而在其他位置熒光強度無明顯變化。見圖1。為進一步量化ROS熒光強度,在原代培養大鼠SGN中,與對照組相比,5 mM SS干預48 h后,ROS平均熒光強度升高(P<0.001),與H2O2組結果一致(P<0.000 1)。見圖2。

注:??為對照組；?為??的融合圖；??為5 mM SS處理組；?為??融合圖

圖2 ROS在原代細胞中的表達及量化(200×)比較圖

2.2氧化應激水平與細胞存活率 用氧化應激抑制劑NAC處理后,與SS處理組對比,SGN氧化應激水平下降(P<0.01)。CCK8實驗顯示,SS處理SGN 48 h后細胞存活率較對照組降低了41.34%(P<0.01)。在加入NAC之后,細胞存活率較SS組上升36.05%(P<0.01),與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。H2O2組處理SGN 48 h后細胞存活率較對照組下降52.31%(P<0.001),在加入NAC之后,SGN氧化應激水平下降(P<0.0001),細胞存活率較H2O2組上升34.73%(P<0.01)。見圖3。

圖3 SGN在不同處理組中的細胞存活率比較圖

3 討論

3.1藥物性耳聾(drug-induced hearing loss,DIHL)是最常見的后天性感音神經性聾。SS作為全球用量最大的非處方藥物阿司匹林的有效成分,可以高效、快速、穩定、可逆地誘導實驗動物耳鳴甚至雙側對稱的以高頻為主的輕度至中度聾,因此是研究DIHL的良好工具藥物。SGN是聽覺神經通路的初級神經元,噪聲、衰老、藥物等各種原因造成的感音神經性聾,最終都造成SGN的不可逆損傷。本研究表明5 mM SS處理原代培養SGN 48 h后,細胞存活率下降。由于SGN缺乏再生能力,SGN的變性和喪失將導致不可逆感音神經性聾。因此,探索SGN損傷的深層機制,對治療DIHL以及其他神經性耳聾具有重要意義。

3.2SS致神經元的損傷與興奮毒性有關。研究發現,SS顯著增加小腦旁絨球的谷氨酸水平,使其興奮性中間神經元自發放電率顯著增加[10]。在聽覺系統中,SS能上調耳蝸背側核[11]、下丘以及聽皮層[12]NMDA受體表達。本課題組的前期研究也證實,SS易化SGN的NMDA受體的電流[13],上調SGN的NMDA受體表達[14],促進GABAA受體內化[15],可逆地抑制GABAA受體電流[16],使興奮與抑制的平衡失調。這一系列的研究結果證實了SS可通過興奮毒性介導SGN損傷。

3.3SS致神經元損傷的發生發展與氧化應激、凋亡密切相關。ROS通過引起細胞內酶活性改變、蛋白質變性、細胞膜結構、功能破壞等最終導致神經元變性或壞死[17]。本研究發現SS處理耳蝸器官48 h后,ROS在SGN上顯著升高,而在支持細胞、成纖維細胞等其他細胞中無明顯變化,提示SS選擇性增強SGN的氧化應激水平。應用氧化應激抑制劑NAC可顯著降低SGN的氧化應激水平,使細胞存活率上升,與陽性對照結果一致,提示SS通過增強氧化應激造成SGN死亡。本課題組此前的研究也發現在體外培養的大鼠耳蝸器官中,SS作用48 h后導致SGN發生神經纖維水泡化和斷裂,核固縮和核碎裂等凋亡形態學改變,并且具有SS濃度及處理時間依賴性。然而,毛細胞及支持細胞即使在SS高濃度(10 mM)和長時間(96 h)的處理下,仍然沒有明顯的形態學損傷表現。SS處理后,只有SGN中的過氧化物陰離子增加,這提示SS可能選擇性地導致SGN產生氧化應激損傷[9]。Abd-Elhakim等[18]研究發現在大鼠大腦皮層和海馬組織中,SS提高了丙二醛和caspase-3水平,但總抗氧化能力和B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)水平降低,神經元變性壞死。另外,SS使人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y內的ROS水平增加,caspase-3表達增加,導致SH-SY5Y細胞凋亡[8]。其他的非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)如雙氯芬酸作用SH-SY5Y后,使ROS水平升高,caspase-3、caspase-8、bax、細胞色素c和p53表達水平升高,抗凋亡Bcl-2水平降低,引起氧化應激和細胞凋亡[19]。不僅在神經元中,SS亦造成其他細胞的氧化應激和凋亡。研究發現SS可以通過激活Rac1-NAPDH氧化酶依賴途徑使ROS增加,進而造成線粒體膜電位下降,caspase激活,導致胃癌細胞凋亡[20]。在PEL原發性滲出性淋巴瘤細胞和C6膠質細胞中,SS均導致ROS大量生成,最終造成細胞凋亡[21-22]。這一系列的研究結果表明,SS通過氧化應激介導SGN損傷。

3.4在神經元中,胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)升高能夠增強氧化應激。在分離的線粒體中發現,高濃度的Ca2+通過開放線粒體通透性轉換孔增加ROS的生成[23]。而在氟化鈉誘導的SH-SY5Y細胞毒性損傷中發現,[Ca2+]i升高伴隨ROS增加,Ca2+螯合劑可以抑制ROS生成,但抗氧化劑不能抑制[Ca2+]i上調,表明[Ca2+]i上調是氧化應激的上游介導因素[24]。SS能升高神經元的[Ca2+]i。小鼠被注射SS后,大腦神經元中鈣相關的活動增強[25]。SS也增強耳蝸背側核神經元的鈣內流[26]。本課題組的前期研究證實了SS易化NMDA受體電流(一種配體門控鈣內流)[13],其他學者也證實了阿司匹林選擇性增強SGN中NMDA誘導的電流[27]。當NMDA受體被過度激活時,[Ca2+]i會急劇上升,并引起興奮毒性[28]。上述結果提示,SS通過易化SGN的NMDA受體,升高[Ca2+]i,并可能由此增強SGN的氧化應激,進而介導SGN損傷。

綜上所述,SS通過增強SGN的氧化應激引起SGN的損傷,使用氧化應激抑制劑能夠降低SGN的氧化應激,并且對SS致SGN損傷具有保護作用。關于氧化應激引起SGN損傷的具體機制仍需要進一步研究。