伊馬替尼聯合重組人干擾素α-2b治療加速期慢性髓性白血病患者的療效及對血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平的影響

王 暉, 李艷春, 高秋英, 張 玎, 鄭 研

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種血液惡性腫瘤,在中老年人群發生率較高,其中以男性患者居多[1]。其發病機制是生成大量不成熟細胞,堆積于骨髓,導致骨髓造血功能障礙,臨床可表現為貧血、感染、出血等,以肝、脾腫大,以及消瘦、盜汗最為常見。臨床上常以基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的水平作為衡量腫瘤活性的標準[2]。MMP-2破壞細胞基膜,加快胞外基質降解[3]。婆羅雙樹樣基因4(spalt-like transcription factor 4,SALL4)是果蠅中婆羅雙樹基因同源基因SALL中的一類,含有鋅指結構域的新反式作用因子,對于保護胚胎干細胞功能具有重要作用。SALL4位于染色體20q13.13-13.2區域,該區域突變通常與腫瘤發生有關[4]。血清α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein,AGP)屬于急性時相反應蛋白,與惡性腫瘤發生、發展具有關聯性[5]。伊馬替尼屬于酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)抑制劑,對治療CML具有持久的血液和遺傳學反應,可有效緩解病情,是目前CML的一線治療藥物。干擾素可與細胞膜上的受體結合,促進蛋白質合成,降低腫瘤基因的表達水平。重組人干擾素α-2b(recombinant human interferon α-2b,IFNα-2b)是CML的傳統治療藥物,但長時間使用會降低治療效果。IFNα-2b與伊馬替尼聯合使用能產生協同效應,提高療效[6]。然而,目前關于伊馬替尼聯合IFNα-2b治療加速期CML患者的研究尚少,其對血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平影響的研究更為鮮見。鑒此,本研究旨在探討伊馬替尼聯合IFNα-2b治療加速期CML患者的療效以及對血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平的影響,為優化臨床CML的治療方案提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2017年1月至2021年1月陜西省人民醫院收治的加速期CML住院患者90例。采用隨機數字表法將其分為觀察組(采用伊馬替尼聯合IFNα-2b治療,45例)和對照組(采用伊馬替尼治療,45例)。兩組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。研究獲醫院醫學倫理委員會批準(批號:L164835),研究對象均簽署知情同意書。

表1 兩組基線資料比較

1.2納入與排除標準 納入標準:(1)符合《中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016年版)》[7]中關于CML的診斷標準,Ph染色體和(或)BCR-ABL融合基因陽性[8];(2)加速期CML患者,即原始細胞占比為10%～19%,外周血中嗜堿性粒細胞≥20%,對治療無反應或非治療引起的持續血小板減少(<100×109/L)或增高(>1 000×109/L),治療過程中出現基于Ph染色體的克隆演化,呈現出進行性脾增大或白細胞增高[9];(3)年齡≥18歲。排除標準:(1)合并其他疾病,需使用與研究藥物可能存在相互作用的藥物;(2)近期接受過TK抑制劑治療且未過洗脫期;(3)合并吸收障礙或存在影響藥物吸收的其他疾病;(4)合并心、肝、腎等重要臟器疾病;(5)曾接受過造血干細胞移植術;(6)妊娠期和哺乳期婦女。

1.3治療方法 對照組給予甲磺酸伊馬替尼片(江蘇豪森藥業股份有限公司,國藥準字H20133200,規格0.1 g×12片)治療,初始治療劑量為400 mg/d,進餐時服藥,1次/d,出現耐藥后(治療后效果不明顯),劑量增至600～800 mg/d。出現藥物不良反應(主要為胃腸道反應導致的惡心嘔吐、腹痛腹脹等現象;骨髓抑制導致的白細胞下降、血小板降低;腫瘤破潰出血、肝腎功能損傷)則立即停藥。觀察組在對照組的治療基礎上給予IFNα-2b注射液(北京凱因科技股份有限公司,國藥準字S20030030,規格0.3 ml∶300萬IU),300萬IU/次,隔天肌內注射1次。兩組均持續治療6周。

1.4觀察指標

1.4.1 臨床療效 參考《中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016年版)》[7],于治療期結束后進行評估。(1)完全血液學緩解(complete hematological remission,CHR):P190和P210的BCR-ABL融合基因分別下降2.9和2.0個對數;(2)完全細胞遺傳緩解(complete cytogenetic remission,CCyR):要求至少檢查20個有絲分裂中期相,未見Ph染色體;僅存在b2a2和(或)b3a2 BCR-ABL1轉錄本的患者進行分子學緩解評估。(3)主要分子學反應(major molecular response,MMR):BCR-ABL1轉錄本水平≤0.1%。

1.4.2 血清學指標 于治療前后抽取患者空腹靜脈血5 ml,離心后取上清液。通過微孔板檢測器(北京諾匯誠科技有限公司,Spark 10M)采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及MMP-2水平。試劑盒均購自上?？瓢┥锛夹g有限公司,檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 SALL4 mRNA表達水平 于治療前后抽取患者靜脈血2 ml,分別置于經乙二胺四乙酸處理的15 ml無酶離心管內。30 min內進行以下操作:在離心管內加入3 ml紅細胞裂解液,輕輕振蕩混勻后靜置10 min,室溫下470×g離心5 min,棄上清液。重復裂解紅細胞1次,加入1 ml Trizol試劑,-70 ℃保存備檢。采用Trizol法提取標本總RNA,以紫外分光光度儀測定總RNA含量。每份標本取總RNA 1 μg,通過逆轉錄試劑盒將其逆轉為cDNA,并以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR),擴增片段長度為143 bp。反應總體積25 μl:cDNA 50 ng、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl 24.0 mmol/L、上下游引物各0.4 μmol/L、EvaGreenPCR核酸染料(20×水溶液)1.2 μl、50×熒光參比溶液0.5 μl、DNA聚合酶1.0 U。所用引物序列見表2。所用儀器為PE9600型PCR擴增儀(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。反應條件:94 ℃預變性4 min,變性30 s、61 ℃(ABL 60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s、84 ℃(ABL 82 ℃)收集熒光30 s,共50個循環。每次實驗均設立通過測序證實序列無誤的SALL4 cDNA陽性標本作為陽性對照,以雙蒸水作為無模板陰性對照。采用SDS軟件分析檢測數據,以ABL為內參計算SALL4轉錄本的相對定量,NSALL4=SALL4轉錄本的拷貝數/ABL的拷貝數×100%。

表2 引物序列

1.4.4 AGP水平 于治療前后抽取患者空腹靜脈血5 ml,3 500 r/min離心10 min,取血清,-80 ℃保存備檢。采用抗原抗體結合動態測定方法(免疫散射比濁法)對AGP進行檢測。將以等滲鹽水1∶10稀釋的3 μl血清加入300 μl α1-AGP抗體液,充分混勻。延遲時間5～10 s,反應時間5 min,反應溫度37 ℃,測定波長為340 nm。所用儀器為特定蛋白分析儀BN ProSpec(天津通怡科技有限公司),試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4.5 不良反應 觀察患者治療期間不良反應發生情況,包括白細胞減少[低于正常范圍(4～10)×109/L]、血小板減少(<100×109/L)、水腫、惡心、嘔吐、頭疼、發熱的發生情況。

2 結果

2.1兩組臨床療效比較 觀察組治療后獲CHR的人數比例較對照組更高,獲CCyR、MMR的人數比例低于對照組,觀察組整體療效優于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組臨床療效比較[n(%)]

2.2兩組治療前后血清學指標水平比較 兩組血清IL-6、PGE2、ALP、MMP-2治療前水平比較差異無統計學意義(P>0.05),治療后均較治療前顯著降低(P<0.05),且觀察組較對照組更低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組治療前后血清學指標水平比較

2.3兩組治療前后SALL4 mRNA表達水平比較 兩組治療前SALL4 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),治療后較治療前顯著降低(P<0.05),且觀察組較對照組更低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 兩組治療前后SALL4 mRNA表達水平比較 相對表達量]

2.4兩組治療前后血清AGP水平比較 兩組治療前血清AGP水平比較差異無統計學意義(P>0.05),治療后較治療前顯著降低(P<0.05),且觀察組較對照組更低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 兩組治療前后血清AGP水平比較

2.5兩組不良反應發生情況比較 觀察組白細胞減少4例,血小板較少6例,血液學不良反應發生率高于對照組[22.22%(10/45)vs 6.67%(3/45);χ2=4.406,P=0.039]。兩組非血液學不良反應發生率比較差異無統計學意義[6.67%(3/45)vs 4.44%(2/45);χ2=0.000,P=1.000]。兩組總不良反應發生率比較差異有統計學意義(P<0.05)。兩組出現不良反應的患者均采取對癥治療后好轉。見表7。

表7 兩組不良反應發生情況比較[n(%)]

3 討論

3.1CML在慢性白血病中占比較高,患者一般表現為貧血、身體乏力、身體素質下降、肝脾區不適等。這些癥狀并未表現出特異性,常未能引起患者及其家屬足夠的重視而延誤診治,使得大部分患者確診時已處于疾病加速期,嚴重影響患者預后[8]。CML具有Ph染色體,即染色體異常[9]。染色體異常產生的BCR/ABL融合基因可啟動下游多條信號轉導通路,這也是CML的發病機制。流行病學調查研究結果顯示,我國每年CML發病率達(0.39～0.99)/10萬,占所有白血病的10%左右,以中年人群最為常見,其中男性患者相對較多[10]。

3.2CML傳統的治療方法有重組人干擾素-α、化療及干細胞移植等[11]。重組人干擾素-α可對DNA多聚酶的活性產生抑制作用,提升Ph(+)細胞人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子的表達水平,可識別Fas介導的細胞凋亡、調節因子的基因表達、抗原遞呈細胞和T淋巴細胞,繼而發揮抗腫瘤、提升機體免疫力、抑制腫瘤細胞增殖等作用[12]。伊馬替尼屬于2-苯胺嘧啶衍生物,可對TK的活性產生抑制作用,阻斷細胞間的信號轉導,同時可誘導腫瘤細胞生長阻滯以及凋亡,發揮治療CML的作用。其應用于臨床具有起效快、作用時間長和減少腫瘤負荷等優點,然而一部分患者可發生伊馬替尼耐藥,導致治療失敗。與單獨伊馬替尼治療比較,聯合IFNα-2b治療可使患者更早獲得較好的遺傳學反應,且在后期仍可獲得較好的分子學反應。通常而言,分子學反應的提升表明患者生存質量的提升,可減少殘留的微小病灶,因此對腫瘤患者的預后改善具有一定的價值。本研究伊馬替尼聯合IFNα-2b治療并未發現新的嚴重并發癥,血液學不良反應發生率顯著高于單獨伊馬替尼治療,非血液學不良反應與單獨伊馬替尼治療比較無顯著差異,與劉璽等[13]的研究結果相似。

3.3本研究觀察組治療后獲CCyR、MMR的人數比例低于對照組,獲CHR的人數比例高于對照組,提示伊馬替尼聯合IFNα-2b治療的臨床療效優于單獨伊馬替尼治療,能夠緩解患者的病情,促進腫瘤細胞凋亡,考慮這與伊馬替尼和IFNα-2b聯合使用具有協同作用有關。另外,本研究兩組治療后血清IL-6、PGE2、ALP、MMP-2水平均較治療前顯著降低,且觀察組水平較對照組更低,說明伊馬替尼聯合IFNα-2b治療對患者腫瘤的抑制作用更強。MMP-2在腫瘤細胞跨基膜侵犯肝臟、脾臟和淋巴結等器官中發揮著十分重要的作用,治療藥物可控制腫瘤細胞合成MMP-2,抑制新生血管的形成,阻止癌細胞轉移[14]。

3.4根據細胞癌變假說的分子模型,在造血干細胞異常轉化為白血病的過程中SALL4基因可能是較早發生突變的癌基因。SALL4基因在白血病中表達水平升高,使失去自我更新能力的過渡性增生性細胞群體定向祖細胞獲得自我更新能力,使其有機會轉化為白血病干細胞,這可能是SALL4參與白血病發生機制的途徑。SALL4可結合WNT信號通路中的重要調節蛋白β-catenin,從而增強此信號通路活性,激活下游靶基因,導致腫瘤細胞無限增殖,從而引發白血病。本研究兩組治療后SALL4 mRNA表達水平較治療前顯著降低,且觀察組水平較對照組更低,提示藥物通過下調SALL4基因而阻斷WNT信號通路,繼而對下游靶基因的表達產生抑制作用,最終對腫瘤細胞增殖產生抑制作用[15-16]。

3.5本研究兩組治療后血清AGP水平較治療前降低,且觀察組下降幅度較對照組更顯著,分析認為白血病發生過程中AGP的這種變化可能與腫瘤細胞刺激肝臟和腫瘤細胞自身合成糖蛋白存在一定的關系[17-18]。治療過程中,藥物對腫瘤細胞的殺傷力較大,被殺滅的腫瘤細胞釋放糖蛋白;而這種殺傷過程也會對正常組織產生損傷作用,患者可表現出急性時相反應,刺激肝臟合成更多的糖蛋白。上述兩個因素均使血清AGP水平升高,對于治療后病情緩解的患者,機體組織損傷逐漸恢復,白細胞數量下降,AGP水平也隨之下降[19-20]。本研究觀察組白細胞、血小板減少等血液學不良反應發生率顯著高于對照組,而水腫、惡心、嘔吐、頭疼、發熱等非血液學不良反應發生率與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),對此需要進一步加大樣本量進行驗證。

綜上所述,伊馬替尼聯合IFNα-2b治療加速期CML的效果較單獨使用伊馬替尼更優,可降低患者MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平,起到緩解病情的作用,但可能會增加其血液學不良反應的發生風險。本研究為單中心研究,樣本量較小,研究結論還需進一步通過多中心、前瞻性研究加以驗證。