十二卷屬植物新品種‘山之翠’花梗發生培養試驗初報

方連明 姜亮 湯桂鈞 王赟 卜順法 殷家棟 陸錦明

（1 上海市閔行區三農綜合服務中心，上海 201109；2 上海市閔行區農業技術服務中心，上海 201199；3上海銘桂實業有限公司，上海 201101） *為通信作者

十二卷屬花卉是近年來在我國快速發展流行的名貴觀賞花卉，已逐漸走進尋常百姓家，成為了市民選購盆栽中的新寵[1]，極適宜在辦公室、居室、廳堂、陽臺等處作擺放裝飾用，具有清新、優雅之美，同時可吸收空氣中的有害氣體，從而潔凈空氣，具有一定的環保功能。十二卷屬多肉類植物有4 個大類，分別為“萬象”“玉扇”“壽錦”“玉露”，品種繁多，且都有抽生花梗的習性，即在花梗頂端著生幾十朵小花（小花是十二卷屬多肉類植物特有的繁殖器官，但大多是花而不實，需人工授粉）。

十二卷屬植物與很多木本植物及部分草本植物有抽生花梗的相似特性，且其花梗的每個節間中均隱藏有腋芽，故可通過刺激腋芽發育成幼芽，再通過側芽(腋芽)分生組織發育成枝條(植株)[2]?！街洹前俸峡剖韺佟叭f象”系列中的名貴新品種，是國際上著名的“萬象”四大品種之一，種苗價格十分昂貴。在此背景下，為獲得價廉物美的‘山之翠’優質種苗，筆者在數年前獨家引進‘山之翠’專利品種的種苗進行盆栽養護，并應用組織培養技術對其半木質化的花梗，進行了嫩莖段離體發生培養試驗，以期刺激腋芽萌發并長成“叢生芽”，從而為育成試管苗夯實基礎。筆者經過反復試驗，‘山之翠’花梗離體發生培養終獲成功?，F將相關試驗結果報道如下，以供相關人員參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及品種來源

試驗在上海銘桂實業有限公司（上海市松江區場西路398 號）的組織培養室內進行。新品種供試‘山之翠’是由上海銘桂實業有限公司自國外獨家引種的專利品種苗。

1.2 材料處理

1.2.1 材料來源與取材時間

培養材料為盆栽2年后的‘山之翠’大苗。于2021年9月中旬，盆栽的‘山之翠’肉質葉片葉叢中抽出花梗，長度為35 cm 左右；9 月21 日，花梗頂部最下端約有1/4 的花朵已開花，整支花梗有彈性，呈“半木質化”狀態，自基部將整支花梗剪下，并立即將其置于盛有清水的玻璃瓶中，以防花梗失水萎蔫。

1.2.2 外植體材料的清洗與消毒

取材當天，將花梗進行處理。先剪去基部2 cm左右、已老熟以及頂端幼嫩尚未達半木質化的部分，并剪去花蕾（朵），留長度為30～40 cm 的花梗，用洗潔精清洗3 遍，然后將花梗剪成長度為8 cm 左右的嫩莖段，用干凈紗布包裹后置于自來水龍頭下沖洗3 h，再將沖洗干凈的嫩莖段置于超凈工作臺上進行消毒處理，即先用75%酒精消毒1 min、無菌水沖洗1 次，再用15%次氯酸鈉消毒15 min、無菌水沖洗3 次，最后用無菌濾紙吸干水分備用。

1.2.3 嫩莖段切割與接種

在超凈工作臺上將已消毒的嫩莖段切成長為2 cm的莖段，每段帶1～2個莖節，接種于發生培養基上，每瓶接種1個莖段。為比較觀察嫩莖段發生培養與其他培養方法的優劣，以相同品種的肉質葉片和當年授粉獲得的種子為對照，分別接種30瓶進行比較。其中，肉質葉片切成大小為1 cm2的方塊，當年授粉獲得的種子每瓶培養1粒，消毒方法同1.2.2。

1.3 花梗嫩莖段離體發生培養

為獲得合適的‘山之翠’離體發生培養基配方，共配制了6 種配方：(1）MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L ；(2）MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L；(3）MS+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L；(4）MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L；(5）M S+BA 2.5 m g/L+N AA 0.25 mg/L ；(6）MS+BA 3.0 mg/L+NAA 0.30 mg/L。各種培養基配方均加蔗糖30 g/L、瓊脂粉5 g/L、活性炭2 g/L，調節pH 在5.8 左右。每種培養基配方配制30 瓶，每瓶灌裝50 mL 左右的培養基，每瓶接種1 個莖段，不設重復。

1.4 光照與溫度設置

設置培養室溫度為25 ℃、24 h 恒溫。為防止莖段離體消毒后產生褐化現象，接種后第1周內保持暗培養、不加光，第2周開始每天于7:00—20:00用LED 燈給予13 h 的光照，光照強度為3 500 lx 左右，培養架每層間距為40 cm。

1.5 調查統計

分別在培養約30 d、莖段腋芽開始露白萌動后，以及培養約60 d、腋芽明顯伸長（有的長出愈傷組織）后，觀察、調查、統計各培養基配方的莖段存活狀況，目測是否發生褐化或有無萌芽。同時，根據萌芽瓶數，計算“叢生芽”實際發生率(以腋芽伸長3 mm 左右為準)，評價各材料、培養基配方的優劣，篩選出最佳配方。

2 結果與分析

2.1 不同外植體材料的離體發生培養結果比較

由表1可知，采用花梗嫩莖段進行離體發生培養具有顯著優勢，“叢生芽”發生率達到了93.3%。在花梗嫩莖段離體發生培養中，于暗培養、不加光培養1周后觀察，大多數莖段仍保持綠色；在培養2周后，莖段節間腋芽開始萌動露白；在培養30 d 后，露白的節間上開始長出葉原基，并不斷生長；在培養60 d 時，葉原基已長成長度在3 mm 以上的幼芽，并逐漸長成“叢生芽”，預示花梗嫩莖段發生培養法取得基本成功，這一結果與前人的有關研究結果相似[3-4]。在肉質葉片離體發生培養中，于培養30 d后，切口周邊逐漸膨大，以后緩慢長出黃白色的愈傷組織，再經幾周培養，愈傷組織不斷分化成長為半透明的晶狀體（表面凹凸不平），再培養6個月后，愈傷組織表面開始分化出芽點并不斷生長，形成幼芽。在種子離體發生培養中，由于人工授粉結實種子的成熟度不一致，種子又十分細小，導致種子發芽不整齊，發芽率只有56.7%，且發芽后的種苗生長緩慢，生長勢不強，培養半年以上才形成“叢生芽”。以上結果表明，花梗嫩莖段是‘山之翠’外植體離體發生培養的最佳選擇，符合組織培養技術中“從芽到芽”的理論與實踐要求，故利用花梗嫩莖段進行離體發生培養，對于加快繁育‘山之翠’這一名貴品種的優質種苗、保持品種優良性狀等具有積極意義。

表1 不同外植體材料的離體發生培養結果比較

2.2 花梗嫩莖段不同發生培養基配方比較試驗

由表2可知，在6種離體發生培養基配方中，以配方（4）的離體發生培養結果最好。具體表現為：據接種后1周觀察，配方（4）的嫩莖段仍保持綠色，無褐化現象，培養2周后發現，綠色莖段上端與下端切口已膨大并呈黃白色，表明愈傷組織已長出，莖段已進入旺盛生長階段；配方(3)與配方(4)的離體發生培養結果類似；配方(1)和配方(2)的離體發生培養結果一般；配方(5)和配方(6)的莖段上下端切口膨大現象較為突出，這可能與配方中的激素濃度較高有關。在培養近3 周時，配方（4）在莖段節間處的腋芽開始萌動露白，甚至有2 個節間的腋芽同時萌動的現象，在培養30 d 后，露白的節間上開始長出葉原基并不斷生長，在培養60 d 時，葉原基已長成長度在3 mm 以上的幼芽，葉片開始展開，幼葉顏色由黃白色轉為淺綠色，且隨著幼葉的不斷生長，其圓柱肉質形狀的葉片中長出腋芽，起先有1～2 個，以后逐漸增多并由單個腋芽長成小植株，有的在其基部長出小芽（所有這些新芽組成“叢生芽”），這是‘山之翠’組織培養成功與否的起始步，也是關鍵一步；配方（1）、配方（2）的萌芽情況均不理想，莖段腋芽萌動十分緩慢，有的莖段在培養3 周后仍未萌芽，呈“休眠”狀態，直至培養1個月后才稍有腋芽萌動露白，但數量較少；配方（3）的萌芽稍快；配方（5）、配方（6）的萌芽萌動露白與配方（4）差不多同時出現，但其萌動的芽點僅不斷膨大，未長成幼芽，且完全變成了亮白色、半透明的愈傷組織（似“蜂窩”狀，表面有小突起，突起呈淺綠色），約培養半年后，在降低激素濃度后又分化成幼芽，這可能與配方中激素濃度過高密切相關。有研究證實，在激素濃度較高時，有些莖段外植體需通過在愈傷組織階段產生不定芽，這種繁殖途徑的缺點是隨著愈傷組織繼代培養代數的增加，不定芽的形成能力逐漸下降，遺傳不穩定性也隨之增加[5]。

表2 花梗嫩莖段不同培養基配方的離體發生培養結果比較

3 結論與討論

‘山之翠’是國際上十二卷屬“萬象”系列中的四大名貴品種之一，其生長緩慢，繁殖力低下，種苗奇缺，價格極其昂貴。以半木質化的花梗嫩莖段作為外植體進行離體發生培養，是快速獲得優質種苗、保持品種優良特性及遺傳穩定性的捷徑，具有事半功倍的效果。試驗結果證明，采用‘山之翠’的花梗嫩莖段進行離體發生培養具有顯著優勢，在培養2周后，嫩莖段節間腋芽開始萌動露白；在培養30 d后，露白的節間上開始長出葉原基，并不斷生長；培養60 d 時，葉原基已長成長度在3 mm 以上的幼芽，并逐漸長成“叢生芽”， “叢生芽”發生率達到了93.3%，這為以后的繼代增殖培養乃至育出優質試管苗奠定了基礎。其中，培養基配方(4)（MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L）為最適宜進行‘山之翠’花梗嫩莖段離體發生培養的培養基配方，在接種1～2周后，其嫩莖段仍保持綠色，無褐化現象發生，且綠色莖段上端與下端切口已膨大長出愈傷組織，可以為莖段材料積累原始養分并供母體吸收；在培養60 d 時，葉原基已長成長度在3 mm 以上的幼芽，葉片開始展開，幼葉顏色由黃白色轉為淺綠色，且隨著幼葉不斷生長，其圓柱肉質形狀的葉片中長出腋芽，并由單個腋芽長成小植株，有的在其基部長出小芽，由此組成“叢生芽”。

活性炭是一種無機礦物質類吸附劑，對植物組織培養過程中的褐化現象有一定的抑制作用[6]。本試驗在所有培養基配方中均添加了0.2%活性炭，這對抑制外植體材料的褐化起到了一定的作用。同時，筆者觀察到，不添加活性炭時，經過消毒和切割后，‘山之翠’花梗嫩莖段出現了不同程度的褐化或腋芽萌動延遲的現象，這是因為在消毒過程中，‘山之翠’花梗嫩莖段被化學物質殺傷、氧化，而花梗嫩莖段因切割而使多酚類物質自切口外滲，從而發生了褐化、死亡。此外，筆者在實踐中發現，經消毒和切割后的‘山之翠’花梗嫩莖段在接種后，若馬上在加光狀態下進行培養，亦會產生褐化或黃化現象，且即使在添加活性炭后仍有一定程度的褐化現象發生，其發生機理有待進一步研究；而將接種后的培養瓶放至培養室后，在第1周內進行暗培養、不加光，在第2 周后每天給予13 h 的光照，起到了保障嫩莖段正常生長的作用。因此，在發生培養基配方中添加0.2%活性炭及在接種后第1周內進行暗培養，是‘山之翠’半木質化花梗莖段發生培養技術中的輔助方法，可防止或減輕嫩莖段出現褐化或黃化現象，確?；üＤ矍o段的發生培養成功。