DNA甲基化參與LPS對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的影響

張 莉，魏祥飛，冉耀祥，姜毓君，曲 波，王春梅

（東北農業大學生命科學學院，乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

乳腺炎是奶牛飼養過程中較為常見的炎癥性疾病，對世界范圍內乳制品行業造成巨大影響[1]。病原體侵入乳腺組織，繁殖并產生毒素，導致乳房損傷[2]。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、克雷伯氏菌等是引發奶牛乳腺炎的主要病原微生物[3]。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁上主要成分，也是主要致病毒素，進入機體后可激活細胞相關信號通路，促進多種細胞因子特別是炎性因子表達和釋放，引起機體一系列炎癥反應[4]。

乳脂肪、乳糖和乳蛋白是牛奶中重要營養物質，是決定牛奶營養品質的重要指標[5-8]。DNA 甲基化作為主要表觀遺傳修飾機制之一，可在不改變DNA序列情況下調控基因表達[9]。近年來，研究表明DNA 甲基化參與炎癥反應，在奶牛乳腺發育與泌乳調控等方面扮演重要角色[10-12]。AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、增殖、凋亡、代謝等方面發揮重要作用。在哺乳動物細胞中，AKT共有3種亞型，分別為AKT1、AKT2和AKT3，其中僅AKT1 在妊娠期奶牛乳腺中表達上調，且在調節乳汁合成的代謝過程中發揮重要作用[13]。為探究LPS 對奶牛乳腺上皮細胞（Bovine mammary epithelial cells，BMECs）乳糖、乳脂和乳蛋白合成影響及其潛在機制，本試驗構建LPS誘導的奶牛乳腺上皮炎癥細胞模型，檢測DNA 甲基轉移酶DNMT1 和DNMT3A 表達變化、AKT1 基因啟動子甲基化水平變化，檢測泌乳指標，以期發現其內在聯系，為研究LPS對奶牛泌乳功能的影響機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：I 型膠原酶，購自美國Gibco 公司；LPS 購自美國Sigma 公司；RNA 微量提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司；AxyPrep 基因組DNA 小量制備試劑盒，購自美國Axygen 公司；EZ DNA Methylation-LightningTM Kit，購自美國ZYMO RESEARCH 公 司；PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），購自日本Takara 公司；CSN2 一抗，AKT1 一抗，PAKT1一抗，均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；DNMT1、DNMT3A一抗，購自美國Cell Signal?ing Technology 公司；組織細胞甘油三脂（TG）含量酶法測定試劑盒，購自北京普利萊基因技術有限公司；Bovine Lactose ELISA KIT，購自上海瑞番生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。

主要儀器：CO2細胞培養箱購自美國Thermo，Fisher，激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica，PCR儀，購自美國Eppendorf，酶標儀購自美國Thermo Fisher，化學發光成像系統購自英國Uvitec，實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的獲取與鑒定

本試驗選取處于泌乳期的中國荷斯坦奶牛新鮮乳腺組織，利用膠原酶消化法分離得到原代乳腺上皮細胞，向細胞中加入含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素DMEMF12 培養基，置于5% CO2、37 ℃無菌恒溫培養箱中培養。培養體系中含有成纖維細胞和奶牛乳腺上皮細胞，待細胞鋪滿至細胞培養瓶瓶底，利用兩種細胞對胰酶的敏感性和耐受性差異，使用0.25%胰酶進行純化去除成纖維細胞。

采用免疫熒光染色法對純化后奶牛乳腺上皮細胞進行角蛋白18（CK18）染色鑒定。將純化獲得的奶牛乳腺上皮細胞傳代至3.5 cm 細胞培養皿中，待細胞生長密度達到70%左右時，棄培養液，用4%多聚甲醛室溫固定20 min 后加入封閉液（含5%BSA的PBS/T溶液）在37 ℃環境下封閉1 h，然后加入封閉液稀釋的CK18（1∶200）一抗，4 ℃孵育過夜，棄一抗，用PBS清洗細胞后，加入封閉液稀釋的FITC標記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，逐滴加入DAPI 溶液，激光共聚焦顯微鏡檢測乳腺上皮細胞CK18的特異性熒光。

1.2.2 篩選LPS刺激BMECs的最佳劑量

取處于對數生長期的細胞接種于96 孔板，培養24 h 后，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，生長良好時，用0、1、10 和100 μg·mL-1的LPS 分別處理細胞12 h，每個處理設置5個重復。棄上清，每孔加入100 μL 新鮮培養基（含10 μL CCK-8 溶液），繼續培養3 h。在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔吸光值，以細胞抑制率（IR）≤10%為判斷標準，確定LPS 最佳處理濃度。IR=（空白OD-模型OD）/空白OD×100%。

1.2.3 BMECs中AKT1和炎癥因子表達變化

取狀態良好的奶牛乳腺上皮細胞接種于六孔板，待細胞貼壁率達到80%~90%時，棄培養液，分別加入含有濃度為0、1、10 和100 μg·mL-1LPS新鮮培養基繼續孵育12 h。LPS 誘導細胞12 h 后，按照RNA 微量提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，使用NanoDrop2000 測定提取的RNA 濃度、OD260/OD280值及OD260/OD230值，檢測后RNA 應立刻通過PrimeScriptTMRT試劑盒逆轉錄合成cDNA。按照TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書步驟進行RT-qPCR，反應體系為20 μL，反應程序為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，40 個循環。根據GenBank 中牛AKT1、TNF-α、IL-1β及IL-6 的mRNA 序列，借助Primer Premier 5.0 軟件分別設計擴增引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列信息見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescence quantitative PCR

1.2.4 DNMT1、DNMT3A、AKT1 及P-AKT1 蛋白表達水平變化

將各組細胞棄去培養液，經預冷PBS 洗滌3 次后，向各孔內加入200 μL RIPA 裂解液，待細胞裂解充分后將裂解液轉移至1.5 mL離心管，10 000~14 000 g 離心3~5 min，將上清液轉移至新的1.5 mL 離心管，加入等量2×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，超聲3 次，每次15 s。在10%SDS-PAGE凝膠中將蛋白樣品進行電泳分離，然后電轉移至硝酸纖維素膜，將濕轉后硝酸纖維素膜放入TBST配制的5%脫脂乳中37 ℃搖床封閉2 h,將NC 膜 置 于 含 有DNMT1、DNMT3A、AKT1 及PAKT1特異性抗體（所用抗體均屬兔源，按照1∶1 000的比例進行稀釋）的一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜3×10 min，使用HRP 標記的山羊抗兔二抗在37 ℃環境中孵育1 h，再次用TBST漂洗NC膜，ECL化學發光液檢測目的蛋白條帶，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.5 AKT1基因啟動子甲基化水平變化

使用BSP 法檢測AKT1 基因轉錄起始位點上游-2 000~-1 500 bp 區域CpG 島（該CpG 島內共有16 個CG 位點）甲基化情況。使用Axygen 基因組DNA 提取試劑盒提取細胞總DNA 并用NanoDrop 2000 測定其濃度。使用EZ DNA Methylation-Light?ningTMKit 對基因組DNA 進行亞硫酸氫鹽修飾。使用在線網站MethPrimer Home（http://www.urogene.org/）和Primer premier 5軟件設計AKT1啟動子特異性BSP引物，正向引物序列為5'GGAGTAGAGAGTA TTATTTTTGGAAGGT 3'，反向引物序列為5'ACTA CTAACAAAACCAAACAACTATC 3'。以修飾后DNA為模板，使用Taq DNA 聚合酶進行PCR 擴增，擴增產物長度為252 bp。PCR反應條件：94 ℃8 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃40 s，45 個 循 環；72 ℃10 min，4 ℃∞。PCR產物采用Axygen凝膠純化試劑盒進行純化，純化產物克隆到pMD18-T 載體上，并轉化到JM109大腸桿菌感受態細胞中。經涂板，陽性克隆篩選，每個樣品至少挑取10 個克隆送至吉林庫美生物科技有限公司測序。

1.2.6 LPS對奶牛乳腺上皮細胞乳糖、甘油三酯和β-酪蛋白合成的影響

采用裂解液低溫處理細胞約10 min，短暫離心后收集上清70 ℃加熱10 min，按照組織細胞甘油三酯（TG）含量酶法測定試劑盒說明書操作，檢測各組細胞甘油三酯含量。

收集細胞培養液，3 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉移至新的1.5 mL 離心管中，按照牛乳糖ELISA檢測試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測標準品和樣品OD值。利用已知標準品濃度和對應OD 值作標準曲線，通過標準曲線計算樣品中乳糖濃度。采用Western blot 方法檢測乳奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白含量，具體步驟同1.2.4。

1.2.7 數據處理與統計分析

所有數據均使用GraphPad Prim 8 軟件進行統計分析，結果以平均數±標準差表示，采用單因素方差分析法分析組間差異。P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著，均具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細胞分離培養與鑒定

本研究中原代乳腺上皮細胞是通過酶消化法從奶牛乳腺組織中獲取。成纖維細胞和上皮細胞對胰酶敏感性存在差異，利用這一特點實現兩者分離，達到純化細胞目的。純化的奶牛乳腺上皮細胞呈橢圓形，排列較為緊密。角蛋白18 是乳腺上皮細胞特異性標志蛋白，采用免疫熒光染色法檢測角蛋白18 表達，檢測結果如圖1 所示，細胞核被DAPI 染成藍色，細胞質中綠色絲狀物質為CK-18，圖像融合后可觀察到藍染的細胞核位于呈現綠色熒光的胞質中，據此確定純化得到的細胞為奶牛乳腺上皮細胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18鑒定Fig.1 Identification of keratin 18 in bovine mammary epithelial cells

2.2 LPS刺激BMECs的最佳質量濃度

設置3 組不同濃度LPS 分別處理BMECs 12 h，結果如圖2A 所示，隨濃度增加，LPS 對細胞活性抑制作用也逐漸增加，具有劑量依賴性。1 μg·mL-1LPS 抑制率為3.52%，10 μg·mL-1LPS 抑制率為9.71%，因此，按照細胞抑制率（IR）≤10%判定標準，選擇10 μg·mL-1作為誘導炎癥反應發生的最佳質量濃度。

圖2 LPS對奶牛乳腺上皮細胞的影響Fig.2 Effects of LPS on mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

2.3 炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達

為驗證LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型可靠性，采用RT-qPCR 法檢測奶牛乳腺上皮細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA 含量，由圖2B可知，1、10 和100 μg·mL-1LPS 處理組細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA 含量均極顯著高于空白對照組（P<0.01），且10 μg·mL-1LPS 刺激條件下上述3種炎癥因子表達量均略高于其他處理組，表明LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞體外炎癥模型構建成功，后續試驗均采用10 μg·mL-1LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞構建體外炎癥細胞模型。

2.4 BMECs中甘油三酯合成變化

采用10 μg·mL-1LPS 誘導奶牛乳腺上皮細胞體外炎癥模型后，根據組織細胞甘油三脂酶法測定LPS對奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯合成的影響。結果顯示，與空白對照組相比，在LPS 刺激12 h 后，奶牛乳腺上皮細胞中甘油三酯含量極顯著降低（P<0.01）（見圖3A）。

圖3 LPS對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的影響Fig.3 Effects of LPS on lactation function of mammary epithelial cells in dairy cows

表明LPS 極顯著抑制BMECs 中甘油三酯合成，可能進一步降低乳汁中乳脂含量。

2.5 BMECs中乳糖合成變化

采用牛乳糖檢測試劑盒檢測LPS刺激對奶牛乳腺上皮細胞乳糖合成的影響。結果表明，與空白對照組相比，炎癥模型組中乳糖含量極顯著降低（P<0.01，見圖3B）。表明LPS 對BMECs 中乳糖合成和分泌具有極顯著抑制作用。

2.6 BMECs中β-酪蛋白合成變化

采用Western blot 檢測LPS 刺激對奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白合成的影響。結果顯示，與空白對照組比較，LPS處理的奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白表達量極顯著下降（P<0.01，見圖3C和D）。表明LPS 抑制β-酪蛋白合成，并可能進一步降低乳蛋白含量。

2.7 AKT1基因表達變化及P-AKT1蛋白含量檢測

采用熒光定量PCR 檢測LPS 對AKT1 mRNA 表達的影響，采用Western blot 檢測LPS 對AKT1 和P-AKT1 蛋白表達的影響，結果見圖4，LPS 處理組中AKT1 mRNA 表達量極顯著低于空白對照組（P<0.01），AKT1 和P-AKT1 蛋白表達量均極顯著低于空白對照組（P<0.01）。結果提示，LPS 抑制AKT1基因表達，且抑制AKT1蛋白激活。

圖4 LPS對奶牛乳腺上皮細胞中AKT1基因表達及AKT1蛋白磷酸化的影響Fig.4 Effects of LPS on AKT1 gene expression and AKT1 protein phosphorylation in mammary epithelial cells of dairy cows

2.8 DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3A表達量檢測

采用Western blot 檢測LPS 對BMECs 中DNMT1和DNMT3A 表達水平的影響。結果顯示，與空白對照組相比，LPS 處理組DNMT1 和DNMT3A 蛋白表達極顯著上升（P<0.01，見圖5）。上述結果提示，DNA 甲基轉移酶表達顯著上調可能導致部分泌乳相關基因甲基化水平升高，進一步抑制其表達。

圖5 LPS對奶牛乳腺上皮中DNMT1和DNMT3A蛋白表達的影響Fig.5 Effects of LPS on DNMT1 and DNMT3A protein expression in mammary epithelial cells of dairy cows

2.9 AKT1基因啟動子甲基化水平檢測

收集LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞樣品，提取細胞全基因組DNA，通過BSP方法檢測AKT1啟動子甲基化水平。根據AKT1基因啟動子區CpG島位置設計BSP引物，以亞硫酸氫鹽修飾后基因組DNA為模板，使用Taq酶進行PCR擴增反應，擴增后產物長度為252 bp，包含16個CG位點，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、DNA膠回收、連接及轉化后，挑取陽性單克隆菌落送至生物公司測序。電泳檢測結果見圖6A，目的條帶大小與實際相符，表明該BSP引物有效擴增出目的基因片段。甲基化水平檢測結果見圖6B和C，與空白對照組相比，LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞12 h后，AKT1基因啟動子甲基化水平極顯著升高（P<0.01），上升至18.75%，表明BMECs發生炎癥反應后，AKT1表達受甲基化調節，AKT1啟動子甲基化水平受LPS作用影響。

圖6 LPS對奶牛乳腺上皮細胞中AKT1基因啟動子甲基化水平的影響Fig.6 Effects of LPS on methylation level of AKT1 gene promoter in mammary epithelial cells of dairy cows

3 討 論

在乳腺炎發生過程中，炎癥部位細胞短時間內產生大量炎癥因子，Wu 等發現LPS 刺激奶牛乳腺上皮細胞后，促進腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）等炎性細胞因子分泌[2]。因此炎癥因子表達量增加作為乳腺炎發生重要特征之一，可衡量乳腺炎癥模型構建是否成功。本研究在LPS 刺激BMECs 后通過對細胞活性、炎癥因子表達及泌乳指標檢測驗證，成功構建奶牛乳腺上皮炎癥細胞模型，為進一步探究乳腺炎致病機制和治療靶點提供一個良好平臺。

研究發現，LPS 在誘導BMECs 炎癥反應同時還抑制BMECs 增殖，最終導致細胞損傷和凋亡[14-16]。眾所周知，AKT1 基因在調控細胞增殖、細胞存活及細胞凋亡等方面發揮重要作用，Lin等研究顯示當沉默AKT1基因表達時，奶牛乳腺上皮細胞活力和增殖活性均顯著降低[13]。Che 等研究報道AKT1 基因激活促進小鼠B 細胞增殖和分化[17]。在小鼠C2 成肌細胞中，沉默AKT1 基因表達顯著降低細胞周期蛋白A含量，誘導細胞周期停滯，表明AKT1 可通過調控細胞周期進程影響細胞增殖[18]。本研究通過CCK8 法檢測細胞增殖活性，通過RT-qPCR 檢測AKT1 mRNA 水平表達，Western blot 檢測AKT1 和P-AKT1 蛋白水平表達，結果表明經LPS處理后，細胞增殖活性受抑制，奶牛乳腺上皮細胞中AKT1 mRNA、AKT1及P-AKT1蛋白表達均極顯著降低，該結果提示LPS對奶牛乳腺上皮細胞增殖活性的抑制作用可能是通過AKT1 基因介導。

牛奶中乳蛋白、乳脂和乳糖含量是評價乳品質主要指標，其合成受諸多因素影響[19-20]。本研究發現，在10 μg·mL-1LPS處理12 h條件下，奶牛乳腺上皮細胞中乳脂、乳糖、乳蛋白含量均顯著降低。關于LPS所致奶牛泌乳功能降低的分子機制復雜，涉及DNA 甲基化等方面內容鮮有報道。已證實AKT1促進乳糖、乳脂和乳蛋白合成和分泌，在奶牛泌乳調控中發揮重要作用[13,21-22]。實驗室前期工作也發現高產和低產奶牛乳腺組織中AKT1基因啟動子甲基化水平存在顯著差異，確定AKT1啟動子甲基化水平與乳成分合成呈負相關[23]。因此，本研究檢測奶牛乳腺上皮炎癥細胞模型中DNA 甲基轉移酶表達變化和泌乳相關基因AKT1啟動子甲基化水平變化，以期探究乳腺炎條件下DNA 甲基化在奶牛泌乳調控中的角色。

DNA 甲基化是由DNA 甲基轉移酶（DNMTs）催化的一種表觀遺傳修飾方式，與多種疾病發生發展和轉錄調控有關[24-25]。哺乳動物中，DNA甲基轉移酶主要包括DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B，其中DMNT1 主要參與維持甲基化狀態，DNMT3A 和DNMT3B 主要負責從頭甲基化。Ma 等研究發現LPS 處理后，人臍靜脈內皮細胞DNMT1 表達顯著增加[26]。Yang等研究表明，LPS誘導豬肺泡巨噬細胞（AMs）12 h，DNMT3A 基因表達增加[27]。Koval?chuk 等發現，小鼠連續2周飲用含LPS的水，顯著上調脾臟中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白表達水平[28]。上述研究結果表明經LPS 處理后，在多種不同類型細胞中均可檢測到DNA甲基轉移酶表達升高，具有普遍性。本研究檢測BMECs 中DNMT1和DNMT3A 表達情況，結果表明LPS 誘導后，DNMT1 和DNMT3A 表達量也顯著增加。另外，AKT1 基因啟動子甲基化水平升高，AKT1 基因表達和P-AKT1 蛋白表達均降低，乳脂、乳糖和乳蛋白合成減少，表明DNA 甲基化參與乳腺炎條件下奶牛泌乳調控，且LPS也可通過增加DNA 甲基轉移酶DNMT1 和DNMT3A 表達提高AKT1 基因甲基化水平，抑制AKT1 基因表達，并影響AKT1蛋白磷酸化水平，抑制乳成分合成，具體作用機制有待進一步研究證實。本研究為LPS對奶牛泌乳功能的影響機制研究提供新思路和研究方向。

4 結 論

綜上，DNA 甲基化參與LPS 誘導的奶牛乳腺上皮細胞中泌乳功能調控，LPS也可通過增加泌乳關鍵基因AKT1甲基化水平抑制其表達，導致奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能降低。