滇東南珍稀古老植物蒜頭果種子結構及子葉多樣性研究

王 娟普 甜

（1. 西南林業大學綠色發展研究院，云南 昆明 650233；2. 西南林業大學林學院，云南 昆明 650233）

云南的東南部是古生代地層出露最豐富、地質歷史最古老的地區之一，在全球廣受第四紀更新世冰蓋侵襲時，滇東南植物區系沒有發生較大動蕩，從而成為第四紀冰期全球生物界的冰期“避難所”，蘊藏了大量的古老、珍稀特有物種資源[1]。特殊的地理位置、古老的地質歷史和優越的氣候條件，為起源古老的生物物種的生存繁衍提供了得天獨厚的條件，使得滇東南成為中國三大特有植物分布中心之一的“滇東南—桂西古特有中心”的重要組成部分。隸屬被子植物中雙子葉植物綱原始花被亞綱檀香目鐵青樹科（Olacaceae）蒜頭果屬（Malania）的蒜頭果（Malania oleifera）也成為了這一區域保留下來的中國特有的單種屬的孑遺植物，僅零星分布于云南的廣南縣和富寧縣，以及鄰近的廣西西部那坡縣等海拔300~1 500 m 喀斯特山地的常綠闊葉混交林中，現存野生資源量有限，被列為國家II 級保護物種之一。蒜頭果種仁胚乳中富含油脂（51.85% 以上）[2]，是當地居民傳統食用油之一。蒜頭果種仁油中含有高達40% 以上的神經酸，是迄今為止發現神經酸含量最高的木本植物[3]。神經酸能夠促進受損傷神經組織修復和再生，對預防老年癡呆或輔助治療老年性認知功能障礙有獨特療效[4-5]。因此，具有重要的保護價值和潛在的醫藥利用與經濟價值。

蒜頭果的外觀特征、種子萌發與馴化栽培、營養價值、脂肪酸成分及其含量等已有不少研究[2,6-7]，但有關蒜頭果種子及其種胚的形態與結構的研究未見報道。種子是植物長期系統演化過程的產物，種胚作為種子最重要的組成部分，是幼小植物體的雛形被保護在種子的結構中，其結構特征是穩定和保守的。種胚一般由胚芽、子葉、胚軸和胚根4 部分組成，其中子葉數目及形態通常是種胚變異最小的性狀之一[8]，不僅對植物生長發育甚至產量具有重要作用[9-10]，而且還能反映植物的進化及其系統發育。種子植物依據子葉數量劃分為單子葉植物、雙子葉植物和多子葉植物三大類群，多子葉結構一般只存在于裸子植物的種胚中。對處于被子植物基部位置古老的雙子葉植物—蒜頭果的多子葉現象的研究，對了解蒜頭果的系統地位、揭示其種群構建等生態學規律具有重要的理論意義。蒜頭果分類學研究歷史顯示，最早的報道曾將蒜頭果置于茶茱萸科[11]和樟科[12]中，至1980 年才作為鐵青樹科一新屬和新種，有了合法的名稱和明確的系統位置。蒜頭果的分類研究有文獻記載僅40 余年歷史，本研究通過對蒜頭果果實特征與結構、種子結構及天然分布于不同海拔的蒜頭果的種胚子葉數量等內容的研究，為蒜頭果不同種源的良種選育、種子萌發及規?；嘤炝殖苫盥逝c保存率低等問題奠定基礎，也為更深入認識蒜頭果的系統分類地位和種子植物中子葉數量的演化規律或趨勢提供了更豐富的信息和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源及取樣方法

供試蒜頭果果實于2020—2022 年每年的10 月采自文山州富寧縣和廣南縣有野生蒜頭果分布的鄉鎮。

1.2 果實和種子基本特征觀測

1.2.1 果實和種子結構特征觀察

隨機取100 粒蒜頭果果實標記編號，用游標卡尺測量已編號果實的縱徑（LD-F） 、橫徑（TD-F） ，稱量單果質量（FW）。果柄著生部位至果實頂部的距離為縱徑，垂直縱徑果實最寬處為橫徑，橫徑按兩個方向測量2 次，取平均值。將肉質果皮與果核（種子）分離，測量每粒種子的縱徑（LD-S）和橫徑（TD-S） ，稱量每粒種子質量（SW）。果柄的脫落處到種孔的距離為縱徑，垂直縱徑種子最寬處為橫徑，橫徑按兩個方向測量2 次，取平均值作為種子橫徑。果實和種子的縱徑、橫徑測量精度為0.01 cm；質量精度為0.01 g。果皮厚度計算方法參考文獻[13]。

1.2.2 果實和種子各部分含水率測定

含水量測定按GB/T 3543. 6—1995[14]，用四分法隨機取20 個新鮮蒜頭果果實作為1 個果樣，稱量鮮果質量（T-FW），重復5 次，共計100 粒果實。稱量每個果樣果皮總質量（T-PW）和種子總質量（T-SW）。剝出被堅硬的種殼包被的胚乳和胚，按果樣編號稱量種殼質量（T-ScW）、胚乳質量（T-EnW ）和胚質量（T-EmW）。將5 個果樣的果皮、種殼、胚乳和胚分別編號后放入75 ℃的烘箱中烘干至恒質量，記錄每組果樣的果皮、種殼、胚乳和胚的恒重質量，即為干果質量。

1.3 胚乳和種胚觀測

取1.2.1 中已編號和稱重的100 粒種子，用游標卡尺測量胚乳縱徑長（LD-En）和橫徑長（TD-En），在徠卡502 體式顯微鏡下測量胚長和觀測子葉數量，計算胚率。

在徠卡502 體式顯微鏡下觀察統計已編號和稱重的100 粒種子中的種胚的子葉數量，分別計數100 粒種胚中子葉數量的分布。

1.4 不同海拔蒜頭果種子子葉數觀察

分 別 在海 拔400、600、800、1 000、1 300、1 400、1 500 m 處，各選擇3 株野生蒜頭果植株，每株采集果實100 粒，每株隨機取10 粒，重復2 次，即每株共選取20 粒果實用于統計種胚子葉數量，每個海拔段共取樣60 粒，統計每個海拔段種子中種胚的子葉數量占取樣數的比例。

1.5 蒜頭果種子石蠟切片制作

取蒜頭果種子，剝去種殼確定種胚位置后，將包被著種胚的胚乳切成5～8 mm 見方的塊段，迅速放入FAA 固定液中，并用注射器來回抽氣幾次，直至未見氣泡產生后，放入準備好的固定液瓶中，固定液與材料體積比不小于20∶1，在固定液中固定48 h 以上。使用不同濃度的乙醇脫水，濃度由低到高，間隔為2 h，二甲苯透明6 h，浸蠟48 h 以后包埋。切片厚度為10～12 μm，展片用蛋白甘油，番紅固綠二重染色，中性樹膠封片。OlympusBX53 顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 蒜頭果果實形態與結構

蒜頭果果實由復雌蕊心皮發育而成核果，每年9 月底至10 月上旬果實成熟。成熟果實果皮表面光滑無毛或有時被白粉，呈綠色或灰綠色，果實內含1 粒種子，由果皮和種子2 部分組成。種子與果柄連接處的頂部形成凸起，形似一獨蒜頭，因此得名蒜頭果（圖1a~c）。種孔位于與種柄對應的另一端，種子萌發時，胚根從種孔突破堅硬的種殼。

圖 1 蒜頭果果實與種子形態結構Fig. 1 Morphological structure of fruits and seeds in M. oleifera

果實質量29.72～59.01 g，平均質量39.71 g；果實縱徑33.65～46.02 mm，橫徑38.30～50.16 mm，且變異系數均為0.05。表明蒜頭果果實質量、形狀和大小變異較大，且橫徑長略大于縱徑，呈球形或扁球形。其中，果皮的厚薄不均，縱向果皮厚3.88～9.24 mm，平均厚5.6 mm；橫向厚2.62～6.10 mm，平均厚4.76 mm，縱向果皮略厚于橫向果皮；果皮鮮質量23.24 g，占果實鮮質量的58.52%（表1）。

表 1 蒜頭果果實結構組成Table 1 Fruit quality indexes of M. oleifera

2.2 蒜頭果種子與胚的結構

成熟的蒜頭果種子由種殼和種仁（種仁含胚乳和胚）組成，種仁由胚乳和種胚構成。種子長 ×寬為（20.96～30.82）mm × （28.56～39.73）mm。其中胚乳飽滿，白色，大?。ㄩL × 寬）為（19.86～29.28）mm × （25.85～37.09）mm；種胚小，包藏于胚乳中，胚奶黃色，棒狀體，剝離種殼和胚乳后，種胚長 × 寬為（2.9～6.0）mm × （0.5～0.9）mm，長僅占胚乳縱長的9.77%～19.86%，即種胚僅占胚乳全長的1/5～1/10（圖1b、d）。種胚結構觀測顯示，胚軸短，子葉直立合生并包被胚芽環生于胚軸上端并緊接胚芽的頂端分生組織，下連胚根，子葉和胚芽約占整個胚體體積和解剖結構的1/3，胚根和胚軸約占2/3，形態上已發育形成子葉、胚軸和胚根3 個部分，胚芽仍為一團結構一致的分生細胞，且子葉與胚根、胚軸、胚芽處于同一條線上，但相連接部位界線不清。因此，蒜頭果的種子具有豐富的胚乳，但種胚極小。

2.3 果實與種子各組成部分的干物質及其含水率特征

蒜頭果種子中的胚乳含有高達51.85%以上的油脂及約25% 的神經酸[2]，具有極高的經濟價值。因此，其果實和種子各組成部分干物質及含水率的高低是測算經濟利用與價值的重要基礎數據。蒜頭果單粒鮮果質量（39.71 ± 5.08）g（表1），果實的果皮、種殼和胚乳等各組成部分之間的干物質及含水量存在顯著差異。其中果皮鮮質量（23.34 ± 3.56）g，具有濃郁的杏仁味，富含苯甲醛；種子鮮質量（16.47 ± 2.49）g。因此，果皮和種子分別占果實鮮質量的58.78% 和41.22%。蒜頭果果皮中含水率高達（84.53 ± 0.52）%；果皮和種子干物質質量分別為3.61g 和9.76 g，占果實干物質質量的27.0% 和73.0%。因此，蒜頭果果實鮮果和干果的出仁率分別為41.22%和73.0%。

蒜頭果種子種殼堅硬木質，呈淺黃色或奶油色，表面有細小稀疏的疣狀凸起，質量為（4.81 ±0.42）g，含水率（37.83 ± 1.56）%，約占種子鮮重和干物質量的29.57% 和20.71%。胚乳豐富，呈乳白色，質量約11.60 g，含水率41.42 %，約占種子鮮重和干物質量的70.41% 和79.29%。種胚小，位于胚乳基部（圖1b）靠近種孔一側，通體呈奶油色或淺黃色，重約0.0037 g，含水率高達75.51%，僅占種子鮮重和干物質量的0.022%和0.006%。因此，種子中的胚無論是胚率和胚的質量均極小。蒜頭果種子質量大，胚乳豐富，種胚小，在種殼與胚乳之間可見密生細小短絨毛。

蒜頭果胚乳中富含神經酸，其干物質重分別約占果實和種子的63.64% 和79.29%，即占種子干物質質量的近五分之四，反映了胚乳是果實和種子結構中重要的組成部分，既是最有潛在經濟開發利用價值的主要部分又是提供種胚萌發營養的不可或缺的結構，在蒜頭果的種群繁育中具有不可替代的重要作用。

2.4 蒜頭果子葉多樣性特征

2.4.1 蒜頭果子葉的數量與形態

蒜頭果雖然是雙子葉植物，但其種胚的子葉數量不是恒定的2 枚，而是呈2~5 枚不等。取樣統計100 粒果實的子葉顯示，具有2、3、4 枚子葉的胚分別占觀察數的 1%、56%和43 %，說明多子葉胚在野生蒜頭果種子中占絕大多數，且是普遍現象。在體式顯微鏡下可見，種胚中子葉間相互緊貼不分開，肉質稍肥厚，呈淡黃色或奶油色；在外形上，種胚萌發前子葉因數量2、3、4、5 枚，分別呈“一字型”（2 枚子葉）、“Y 字型”（3 枚子葉）、“X 型”（4 枚子葉）和“口字型”（5 枚子葉）（圖2a1、b1、c1），這些特征有別于其他的雙子葉植物，也是目前雙子葉植物中首次報道的多子葉現象。

圖 2 蒜頭果種胚中的子葉數量Fig. 2 Number of cotyledons in seed embryo of M. oleifera

2.4.2 不同海拔分布的野生蒜頭果種胚子葉數量的變化

為考察種胚子葉數量隨海拔的變化情況，采集蒜頭果分布區內最低海拔（400 m）到最高海拔（1 500 m）之間7 個海拔段蒜頭果果實，觀察子葉數，結果表明蒜頭果種胚的子葉數量以3~4 枚占絕大多數，2 者合計占87%以上（圖3）。說明蒜頭果種胚中多子葉現象可能是其系統發育中形成的，且隨蒜頭果分布海拔升高，3~4 枚子葉種子的數量呈增加趨勢，而2 枚子葉種子的數量減少。作為雙子葉植物的蒜頭果，其子葉數量以3~4 枚居多，甚至個別出現5 片子葉，是蒜頭果種子中的普遍現象，這一現象對研究蒜頭果遺傳變異的表征和被子植物系統發育具有重要的研究價值和學術意義。

2.5 成熟蒜頭果果實中種子及其子葉的解剖特征

通過石蠟包埋切片觀察顯示，果實成熟時胚長僅2.9～6.0 mm，包含胚根、胚軸、胚芽和子葉4 部分，處于同一條線上，但連接部位界線不清（圖4a）。子葉約占整個種胚長度的50%，而胚芽、胚根和胚軸合占約50%，整個胚未見導管等維管組織的分化，呈幼嫩含水量高的肉質結構。子葉為幼嫩含水量高的肉質片狀結構，因子葉數量不同，橫切面呈不同的形狀，如4 枚子葉為X 型，子葉間上表皮相互間緊貼無間隙（圖4b）；子葉上下表皮及其之間的細胞均排列緊密，由結構一致的核大、質濃的分生細胞組成，僅見維管束原基，且無葉綠體，未見角質層和蠟被等附屬物、未見氣孔器（圖4c）。胚軸極短，胚芽由一團還未分化的分生細胞組成，細胞核大，細胞質濃，細胞近方形，未見葉原基、腋芽原基和維管柱的分化（圖4a、d），組成胚芽的分生細胞被環生于胚軸上端的子葉包被。胚芽下連胚軸但未見明顯的分界線，胚軸下接胚根，胚根的頂端分生組織與根冠的界線明顯，已分化維管束原基（圖4a、f）。從胚根的基本分生組織、根冠及其初見的維管束原基可以看出，根的表皮、皮層及維管束原基均來自共同的分生細胞，且分生細胞未見分層現象（圖4f）。因此，蒜頭果胚根的分生細胞通過分裂，不斷產生一些細胞加入到根中成為新的根部的細胞，同時這些不斷產生細胞的分生細胞仍然保留在分生組織中，這些經過不斷更新始終保留在分生組織中具有分生能力的細胞，是產生根的其他所有細胞的原始細胞。

圖 3 蒜頭果不同海拔不同子葉枚數占比Fig. 3 Percentage of the number of cotyledons of M. oleiferaat different altitudes

成熟蒜頭果果實中胚的解剖結構顯示，種胚長度僅占胚乳長度的1/5~1/10，雖然種胚已有胚根、胚軸和子葉的分化，但胚芽和胚軸均是由細胞核大、細胞質濃的分生細胞組成，未見維管束原基、葉原基和腋芽原基的分化，僅子葉和胚根中可見維管束原基的分化，說明此時種胚還未達到生理和形態成熟。成熟果實離開母體后，其種子尚需要時間完成生理和形態后熟。種子須濕砂層積后，種胚才能完成組織的分化及維管束的形成，進而從環境中吸收水分和營養完成萌發。

圖 4 蒜頭果種胚解剖結構Fig. 4 Anatomical structure of M. oleiferaembryos

a. 胚的縱切面, 示胚被胚乳包圍的格局和子葉、胚芽、胚軸和胚根; b. 葉中部橫切面，示4 枚子葉被胚乳包圍的格局; c. 圖 a 中子葉的局部放大圖, 示葉脈; d. 圖 a 中胚芽的局部放大圖, 示胚芽的基本分生組織; e. 圖 a 中胚根的局部放大圖, 示根冠; f. 圖 a 中胚根的局部放大圖, 示基本分生組織、原形成層和皮層，圖中圓圈代表維管束。GM 為基本分生組織; PR 為原形成層; CX 為皮層; PL 為胚芽; RC 為根冠。

3 結論與討論

3.1 蒜頭果果實與種子的結構

蒜頭果屬有胚乳種子。蒜頭果花期為3~5 月，5 月下旬出現幼果，10 月果實成熟。成熟果實由果皮和種子2 部分構成，分別占果實鮮質量的58.52%和41.47%，占干物質質量的27.0%和73.0%，說明果皮含水量高達73%。

蒜頭果種子由種殼、胚乳和種胚3 個部分構成，種子鮮重12.48～29.61 g。種胚極小，位于胚乳基部近種孔一端，長僅2.9～6.0 mm，占胚乳長的 1/5 ~1/10；胚和胚乳分別占種子干物質量的0.006%和79.29%。因此，無論是胚率和胚的干物質質量均極小，豐富的胚乳為蒜頭果種子的萌發提供了營養。胚極小，是蒜頭果原始性特征的體現。

3.2 成熟果實的種子因種胚未完成細胞分化而成為生理和形態后熟種子

蒜頭果種子種胚有胚根、胚軸、胚芽和子葉4 個部分，但胚芽和胚軸均由分生細胞組成，未見維管束原基、葉原基和腋芽原基的分化，意味著此時種胚還未達到生理和形態成熟。因此，蒜頭果成熟果實離開母體后，其種子還要經歷生理后熟后才能萌發，這與已有的研究結果認為蒜頭果種子的胚需要經歷約75 d 的生理和形態后熟才能萌發的結論一致[6]。因此蒜頭果種子的生理后熟是由于種胚還未完成細胞分化和組織形成所致，種子砂藏后才能完成生理和形態后熟進而萌發。結合蒜頭果的果實特征，推測在自然條件下，蒜頭果果實成熟后，在其含水量高達58.52%果皮的包裹保護下，種胚才能完成后熟過程是其對生境的適應特征。

3.3 種胚多子葉現象的發現

蒜頭果種胚的子葉數量以3~4 枚居多，是蒜頭果種子中的普遍現象。對不同海拔的種子統計，說明這種現象不是自然變異或基因突變產生，推測是系統發育中形成的，可能與蒜頭果處被子植物基部較原始的位置及其古老特性有關。該發現為研究種子植物系統演化進程中種胚子葉數量演化的規律提供了新案例，也反映了蒜頭果在雙子葉植物系統演化中所處的古老地位。

子葉是植物的重要器官，是植物進化的一個重要標志，是植物變異最小的性狀之一[8]。因此，子葉數目是種子植物劃分為被子植物（包括雙子葉植物和單子葉植物）和裸子植物（多子葉植物）兩大類群的依據之一。被子植物更進化，認為單子葉是由雙子葉的1 個子葉退化形成。有研究認為雙子葉植物中的多子葉現象屬于自然突變，也可人工誘變產生[15-18]，但出現幾率極小。自然突變的如草本植物的四季豆（Phaseolus vulgaris）中發現2～7 片多子葉幼苗[19]；野蘿卜（Raphanus raphanistrum）種子中約占4.8% 萌發的植株子葉數量少于或多于2 片[8]；甘藍型油菜（Brassica napus）的三子葉幼苗[20]，茄(Solanum melongena) 和紅茄(S．Aethiopicum）[21]，仙客來（Cyclamen persicum）[22]，向日葵（Helianthus annuus）品種‘種富陽’幼苗中也有單子葉和三子葉 2 種形態，但所占比例僅分別為2.3%和0.9%[23]。此外，木本雙子葉植物中的楓樹（Acerspp.）也發現有三子葉和四子葉的幼苗[24]；桑樹（Morus alba）的20 個雜交組合獲得的種子中也發現3 枚和4 枚子葉的幼苗，但出現概率僅為0.33～4.5 株/g[25]?？梢?，已有報道無論是草本還是木本的雙子葉植物中自然突變產生的多子葉現象所占比例都非常低，不超過5%，屬零星發生。而蒜頭果的種子中具有3～4 枚子葉的種子數卻占種子數的87% 以上，并隨蒜頭果分布海拔的升高，3 枚和4 枚子葉的種子數呈增加趨勢，甚至零星還可見5 枚子葉的種子。因此，多子葉現象在蒜頭果種子中具有普遍性，這與雙子葉植物類群中已有報道的多子葉現象不同。蒜頭果作為被子植物基部原始花被亞綱檀香目鐵青樹科蒜頭果屬的單種屬植物，具有如此高比例的多子葉的種子存在，故推測不是自然變異或基因突變引起，而是在其系統發育中形成的。

結合已有的研究認為部分植物的三子葉是從雙子葉演變而成，如裸子植物的松柏類的多子葉現象衍生于雙子葉的分裂[26]；也有研究認為雙子葉植物中一些種子會有極少比例出現的三子葉現象是一種“返祖現象”[23]；對桑樹種子的多子葉突變的研究也推測屬于“返祖現象”[25]。結合蒜頭果種胚的多子葉特征，與已有報道的裸子植物中的南洋杉科南洋杉屬的植物有相似性，南洋杉屬中的Eutacta 組植物具有4 枚分離的子葉，而其他種均為2 枚子葉[27]。推測蒜頭果可能是被子植物演化環節中的一個重要物種，但需要通過胚胎學對其多子葉形成進行研究，為深入了解單子葉植物和雙子葉植物的進化過程提供基礎數據和參考。蒜頭果是鐵青樹科蒜頭果屬的單種屬植物，科中還有26 屬多達200 余種植物[28]未見多子葉現象的報道。因此，蒜頭果種胚中多子葉的形成機制、途徑與其他近緣種關系的研究，能為進一步認識蒜頭果的系統分類地位及其演化關系提供重要信息和證據。

致謝： 感謝趙瑞同學在富寧縣和廣南縣不同海拔區域采集的蒜頭果果實，為種胚子葉數量隨海拔的變化提供了觀測材料。