基于網絡藥理學及藥理實驗驗證探討仙鶴草抗肝纖維化的作用機制

李麟　賴俐伶　劉華寶

摘要 目的：探究仙鶴草抗肝纖維化的作用機制。方法：根據多種規則篩選仙鶴草化學成分，預測獲得靶基因，與肝纖維化發病機制相關的靶點進行比對獲得仙鶴草抗肝纖維化的可能作用靶點。通過生物學信息注釋庫DAVID對關聯靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，采用Cytoscape構建仙鶴草化合物-靶點-信號通路相互作用網絡圖。進一步采用實驗驗證仙鶴草對大鼠肝星狀細胞-T6（HSC-T6）肝纖維化指標α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原1型α1（COL1A1）及蛋白激酶B（AKT）蛋白磷酸化的影響。結果：關鍵靶點主要為AKT1、STAT3、Caspase-3、Jun、ESR1等，主要參與調控腫瘤信號通路、PI3K/AKT信號通路、腫瘤蛋白聚糖、胰島素抵抗和FoxO信號通路等。仙鶴草提取物可抑制HSC-T6中α-SMA、COL1A1蛋白的表達，升高AKT的磷酸化水平，驗證了網絡藥理學分析的部分預測結果。結論：仙鶴草可通過作用于PI3K/AKT信號通路等發揮抗肝纖維化作用。

關鍵詞 仙鶴草；肝纖維化；網絡藥理學；PI3K/AKT信號通路；靶點

Anti-liver Fibrosis Mechanism of Agrimoniae Herba Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

LI Lin，LAI Liling，LIU Huabao

（Department of Hepatic Diseases，Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 400021，China）

Abstract Objective：To explore the anti-liver fibrosis mechanism of Agrimoniae Herba.Methods：The chemical compounds of Agrimoniae Herba were screened out by multiple methods and the target genes were predicted and obtained.The potential targets of Agrimoniae Herba against liver fibrosis were obtained through the comparison with the targets related to the pathogenesis of liver fibrosis.Gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis were carried out for associated targets through DAVID.The chemical compound-target-pathway interaction network was visualized by Cytoscape software.The effects of Agrimoniae Herba on the expression of α-smooth muscle actin（α-SMA） and collagen type 1 alpha 1（COL1A1） and the phosphorylation of protein kinase B（AKT） in rat hepatic stellate cell-T6（HSC-T6） were further verified by experiments.Results：The key targets were mainly AKT1，STAT3，caspase-3，Jun，and ESR1，which were mainly involved in the regulation of tumor signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，tumor proteoglycans，insulin resistance，FoxO signaling pathway，etc.Agrimoniae Herba extract could inhibit the protein expression of α-SMA and COL1A1 and increase the phosphorylation level of AKT in HSC-T6，which verified the partial prediction results of network pharmacological analysis.Conclusion：Agrimoniae Herba could inhibit liver fibrosis by acting on the PI3K/AKT and other signaling pathways.

Keywords Agrimoniae Herba; Liver fibrosis; Network pharmacology; PI3K/AKT signaling pathway; Target

中圖分類號：R285；R282文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.010

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉積的病理過程，可以表現為肝功能減退、門靜脈高壓等，可導致肝硬化、肝癌等嚴重后果［1］。肝纖維化是向肝硬化發展的必經階段，也是影響慢性肝病預后的重要環節，嚴重影響了我國人民的身體健康和生命質量［2］。中醫藥在改善肝纖維化癥狀、恢復肝功能、改善肝內血液循環，甚至逆轉肝纖維化、調節免疫等方面的優勢已成為中西醫共識［3］。

仙鶴草（Agrimoina pilosa Ledeb.，APL）為薔薇科多年生草本植物龍芽草的全草，又名脫力草、龍牙草、馬鞭草、石打穿等，最早見于《淮南草本》。仙鶴草味苦、澀、平，歸肺、肝、脾經，是主要用于治療各種出血證、痢疾、虛癆等病的傳統中藥。仙鶴草的主要成分包括酚類、黃酮類、多糖類、三萜類、鞣質、微量元素如Mg、K和P等物質［4］?，F代藥理學研究表明其具有較強的降血糖、抗腫瘤、抑菌和抗病毒活性［5-7］。本課題組在治療肝纖維化、肝硬化中應用仙鶴草已有多年經驗，臨床療效顯著，并在前期研究中發現仙鶴草具有減輕肝纖維化的作用。

然而，目前對仙鶴草抗肝纖維化的作用機制尚缺乏系統的研究，對其作用機制的研究基本限于單個基因或單項病生機制，而中藥發揮作用具有多成分、多靶點、多通路等作用特點，因此仙鶴草在逆轉肝纖維化中的角色有待系統性的研究。網絡藥理學從系統層次和生物網絡的整體角度出發進行分析，可為中藥的研究提供新思路［8］，故本研究擬采用網絡藥理學的方法構建化合物-靶點-信號通路多層次的網絡圖，對仙鶴草抗肝纖維化可能的作用機制進行初步探索，并通過實驗研究對網絡藥理學的分析結果進行初步驗證，以期為后續的深入研究提供切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 大鼠肝星狀細胞株HSC（肝星狀細胞）-T6由重慶醫科大學附屬第二醫院病毒性肝炎研究所彭明利教授贈送，細胞加入含10%胎牛血清和體積分數為1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

1.1.2 藥物 仙鶴草地上部分干燥全草（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：2002145）由重慶市中醫院肝病科主任醫師劉華寶鑒定為仙鶴草（Agrimoina pilosa Ledeb.）的干燥地上部分。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養基（HyClone公司，美國，貨號：SH30809.01），優級胎牛血清（PAN Biotech公司，德國，貨號：st30-3302p），蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術，貨號：p0013B），兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth Muscle Actin，α-SMA）單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國，貨號：8456），膠原1型α1（Collagen Type 1 Alpha 1，COL1A1）單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國，貨號：91144），兔抗大鼠p-AKT（蛋白激酶B）單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國，貨號：4058），兔抗大鼠AKT多克隆抗體（Cell Signaling，美國，貨號：9272），內參GAPDH多克隆抗體（武漢三鷹生物，貨號：10494-1-AP），二抗（杭州聯科生物，貨號：70-GRT007），IumiQ通用型ECL發光試劑盒（上海圣爾生物，貨號：SB-WB012），CCK8細胞計數試劑盒（同仁化學公司，日本，貨號：CK04）。二氧化碳培養箱（三洋貿易株式會社，日本，型號：MCO-15AC-SC型），垂直電泳轉移裝置（Bio-Rad公司，美國，型號：Mini-PROTEAN Tetra 1658001型），Trans-Blot轉膜裝置（Bio-Rad公司，美國，型號：Mini Trans-Blot Module 1703935型），凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國，型號：CFX96型），脫色搖床（海門市麒麟醫用儀器廠，型號：TS-2000A型），酶標儀（Bio-Tek儀器有限公司，美國，型號：ELX800型），高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：TG16-WS型），-80 ℃低溫冰箱（海爾生物醫療股份有限公司，型號：DW-86L388J型）。

1.2 方法

1.2.1 仙鶴草化合物的收集與篩選 通過檢索臺灣中醫藥資料庫（TCM Database@Taiwan，http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw）、中藥分子機制的生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）、網絡藥理學在線數據庫TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid）、化學專業數據庫（http：//chemdb.sgst.cn/scdb/default.asp）、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），收集整理仙鶴草化學成分，并經TCMSP對各化合物進行口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）分析（篩選標準：OB≥30%，DL≥0.18），或根據類藥五原則（Lipinski Rule of 5）進行篩選，并檢索文獻中已報道的仙鶴草主要活性成分。

1.2.2 仙鶴草的靶點預測 使用ChemDraw Professional 16.0統計軟件繪制化合物結構，轉換為*.mol2格式文件，導入PharmMapper在線平臺（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper），采用反向分子對接的方法進行潛在靶點的預測。從有機小分子生物活性數據（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TCMSP數據庫獲取化合物Smiles格式，導入SWISS Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）預測潛在靶點。將獲得的結果輸入UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org）校正為官方名稱（Official Symbol）。對數據庫的預測結果匯總、去重，作為仙鶴草化合物的預測靶點以進一步分析。

1.2.3 肝纖維化發病機制相關靶點的收集 從人類孟德爾遺傳在線數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org）、療效靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、綜合性藥物數據庫（Drugbank，https：//www.drugbank.ca）、PolySearch2系統（http：//polysearch.cs.ualberta.ca）、人類基因數據庫（The Human Gene Database，GeneCards）（https：//www.genecards.org）分別檢索關鍵詞“liver fibrosis”或“hepatic fibrosis”和“cirrhosis”或“hepatocirrhosis”以尋找與肝纖維化相關的基因，利用韋恩圖將預測靶點和肝纖維化相關基因進行比對，得到與仙鶴草和肝纖維化相關的關聯靶點。

1.2.4 通路注釋及“化合物-靶點-信號通路”網絡的構建 將獲得的靶點導入DAVID數據庫（http：//david.ncifcrf.gov）進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，利用Graphpad Prism軟件作圖。將得到的化合物、靶點和信號通路導入到String數據庫（https：//www.string-db.org/），構建化合物-靶點-信號通路網絡圖，將結果導入到Cytoscape軟件中構建化合物-靶點-信號通路網絡圖，并利用Network Analyzer插件進行網絡拓樸學分析，尋找關鍵節點和主要成分。

1.2.5 仙鶴草提取物的制備及其對HSC-T6活性和凋亡的影響 稱取500 g仙鶴草飲片，加入6倍質量體積的蒸餾水，常溫浸泡30 min后煎煮，待煎煮液冷卻后過濾，重復3次，合并濾液進行旋蒸濃縮，制成質量濃度為50 mg/mL的仙鶴草提取物（APLE，主要含有仙鶴草酚、仙鶴草素、兒茶素、香豆素、咖啡酸等成分），使用時以DMEM培養基稀釋至所需濃度。取對數生長期的大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，接種于96孔板中，4×103個/孔，200 μL/孔，分別設空白對照組、APLE 0.5 μg/mL組、5 μg/mL組、50 μg/mL組、500 μg/mL組和5 mg/mL組，每組設6個復孔，重復3次。置于細胞培養箱中分別培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液（5 g/L），繼續培養4 h后棄去孔內上清液，加入100 μL的二甲基亞砜，振蕩10 min，全波長酶標儀450 nm檢測吸光度。細胞增殖抑制率（%）=（1-觀察組光密度450平均值/對照組光密度450平均值）×100%。

取對數生長期的HSC-T6接種于96孔板中，4×103個/孔，200 μL/孔，分別設空白對照組、APLE低濃度組（3 μg/mL）、APLE中濃度組（6 μg/mL）、APLE高濃度組（9 μg/mL）處理HSC-T6，48 h后收集細胞，流式細胞技術檢測HSC-T6的凋亡情況。

1.2.6 仙鶴草提取物對血小板衍生生長因子-BB（Platelet-derived Growth FactorBB，PDGF-BB）刺激HSC-T6中α-SMA、COL1A1表達的影響 取不同濃度APLE作用于PDGF-BB刺激的HSC-T6，提取細胞總蛋白，與上樣緩沖液混勻、100 ℃水浴加熱5 min后冷卻備用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，1%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗孵育60 min。利用凝膠自動成像儀顯影，記錄條帶灰度值，計算α-SMA和COL1A1蛋白相對表達量。

1.2.7 仙鶴草提取物對PDGF-BB刺激HSC-T6中AKT和p-AKT表達的影響 用0.5%小牛血清饑餓同步化過夜處理細胞后，對照組不加藥物處理，PDGF-BB組加入終濃度為10 ng/mL的PDGF-BB處理，APLE+PDGF-BB組先加入終濃度為10 μg/mL的APLE處理1 h后再加入終濃度為10 ng/mL的PDGF-BB處理，各組細胞孵育15 min后提取細胞總蛋白，與上樣緩沖液混勻、100 ℃水浴加熱5 min后冷卻備用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，1%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗孵育60 min。利用凝膠自動成像儀顯影，記錄條帶灰度值，計算AKT和p-AKT蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件處理數據，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用t檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 仙鶴草的活性成分分析 根據篩選規則，共獲得41個化合物。見表1。將篩選出的化合物導入PharmMapper、SWISS數據庫進行靶點預測，對結果進行匯總、去重，最終獲得預測靶點共528個。與肝纖維化相關的基因進行比對后獲得與肝纖維化相關的靶點共72個。

2.2 關聯靶點的GO和KEGG結果 對72個關聯靶點進行生物學功能注釋分析，得到與肝纖維化關聯度較高（P<0.01）的GO富集分析結果。仙鶴草抗肝纖維化靶點主要富集的部分生物過程等。見圖1。對關聯靶點進行信號通路注釋，得到與肝纖維化關聯程度較高（P<0.01）的部分KEGG富集分析結果。主要富集于Pathways in cancer、PI3K/AKT signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Insulin resistance和FoxO signaling pathway等信號通路。見圖2。

2.3 仙鶴草抗肝纖維化化合物-靶點-信號通路網絡圖的建立 關聯數目靠前5的化合物分別是（+）-Catechin-5-O-glucoside、Agrimol F、Agrimol G、Agrimol C、Gamma-Sitosterol。網絡圖中AKT1、STAT3、Caspase-3、Jun、ESR1等基因的連接度排名靠前。見圖3。

2.4 仙鶴草提取物對HSC-T6活性和凋亡的影響

隨著提取物濃度的增加，HSC-T6的受抑制作用越明顯。見表2。與空白對照組或APLE低濃度組比較，APLE中濃度組和高濃度組的細胞凋亡率顯著升高。見表3。

2.5 仙鶴草提取物對PDGF-BB刺激后HSC-T6中α-SMA、COL1A1表達的影響 PDGF-BB處理后細胞內α-SMA表達明顯增加，加入APLE處理后，α-SMA和COL1A1蛋白的表達均降低。見圖4A。

2.6 仙鶴草提取物對PDGF-BB刺激后HSC-T6中AKT和p-AKT表達的影響 PDGF-BB處理后細胞內AKT磷酸化水平明顯增加，APLE處理后PDGF-BB刺激的大鼠HSC-T6內AKT磷酸化水平明顯受到抑制。見圖4B。

3 討論

肝纖維化相當于中醫學的“黃疸”“鼓脹”“積聚”等疾患早期，各種病因導致的病理產物且具有共性病理特征。如《素問·平人氣象論篇》曰：“溺黃赤安臥者，黃疸，……目黃者曰黃疸?！薄峨y經·五十五難》云：“故積者，五臟所生；聚者，六腑所成也……故以是別知積聚也?！薄鹅`樞·水脹》言：“腹脹，身皆大，大與膚脹等也。色蒼黃，腹筋起，此其候也?！敝嗅t認為多種因素綜合作用于機體，導致肝絡瘀滯不通、疏泄失職，肝體失卻柔潤，而發展為肝纖維化［9］。仙鶴草具有補虛扶正、化瘀散結的功效，現代藥理學研究發現仙鶴草主要通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抗氧化等方式發揮作用［10-11］，而鮮有對其抗肝纖維化作用的研究。因此，本研究主要通過網絡藥理學的方法探究仙鶴草抗肝纖維化的物質基礎及作用機制，并進行了初步的實驗驗證。

本課題組前期臨床觀察發現中藥仙鶴草具有確切的抗肝纖維化作用，且本研究實驗驗證顯示仙鶴草提取物能夠降低α-SMA和COL1A1蛋白的表達，減少HSC-T6外基質的沉積，抑制HSC-T6的活化，但其發揮作用的具體機制尚不明確。研究表明仙鶴草可誘導多種細胞凋亡，且本研究也驗證了仙鶴草能促進HSC-T6凋亡。從仙鶴草干燥部位中提取的均質多糖能抑制骨肉瘤細胞株U-2 OS的活力并通過胱天蛋白酶-3依賴的線粒體途徑誘導細胞凋亡，并且這種抑制作用呈劑量依賴性；體內實驗也表明該均質多糖成分對BALB/c裸鼠腫瘤的生長也有抑制作用［12］。張婷婷等［13］發現仙鶴草水提物能顯著抑制人肝癌細胞株HepG2增殖，促進其凋亡，可通過上調線粒體凋亡通路中的B細胞淋巴瘤-2-相關X蛋白）、胱天蛋白酶-3表達誘導細胞凋亡。此外，仙鶴草水提液能抑制人肝癌細胞株SMMC-7721，誘導細胞凋亡，其機制可能與下調B細胞淋巴瘤-2蛋白表達及上調P53蛋白表達有關［14］。唐筱璐研究發現中藥仙鶴草水煎劑可以誘導SMMC-7721細胞發生凋亡，其機制可能是通過抑制細胞內B細胞淋巴瘤-2蛋白和核因子κB（p65）的表達來實現的［15］。因此，結合本研究分析結果，推測仙鶴草可能是通過抑制HSC-T6增殖、誘導細胞凋亡等機制發揮抗肝纖維化的作用。

本研究對仙鶴草所含化合物及預測的靶點進行了網絡拓撲學、GO及信號通路分析，其中PI3K/AKT信號通路已被證實參與肝纖維化發生、發展的多個環節。調控PI3K/AKT信號通路蛋白的表達可抑制HSC增殖、減少細胞外基質的生成與沉積［16］。楊洋［17］發現復方半枝蓮顆?？赏ㄟ^抑制MAPK/ERK-PI3K/AKT信號通路抑制HSC的活化、促進HSC凋亡，從而減輕CCl4肝纖維化模型大鼠的纖維化程度。吳霜［18］發現狗蟻草乙酸乙酯部位能夠通過調控PI3K/AKT信號通路相關基因抑制HSC-T6的增殖，改善CCl4所致肝纖維化小鼠肝臟炎癥及肝纖維化指標。施鳳等［19］發現中藥單體熊果酸能阻斷PI3K/AKT、P38MAPK信號通路、下調基質金屬蛋白酶組織抑制物（Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinasess，TIMP）-1、基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP）-1蛋白的表達并抑制HSC-T6增殖。因此，深入研究仙鶴草調控PI3K/AKT信號通路的具體分子機制可為進一步開發仙鶴草的臨床應用提供新的切入點。本研究實驗驗證顯示經仙鶴草提取物處理后細胞內AKT磷酸化水平明顯受到抑制，表明仙鶴草提取物能夠通過PI3K/AKT信號通路調控HSC-T6的活性，發揮抗肝纖維化作用。此外，本研究分析發現網絡圖中連接度靠前的靶點多位于癌癥信號通路、癌癥中的蛋白聚糖和胰島素抵抗等信號通路上。慢性乙型肝炎、肝硬化患者多伴有葡萄糖代謝紊亂，該部分患者的纖維化指標多與胰島素抵抗呈線性正相關［20］，而既往研究及臨床應用經驗也表明仙鶴草具有抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、降低血糖、改善胰島素抵抗等作用［13-14，21］。由DAVID分析結果可知肝纖維化靶點主要富集的生物學功能為細胞代謝、細胞對化學刺激的反應和細胞對含氧化合物的反應等，表明肝纖維化階段主要為炎癥及細胞內基質代謝異常，同時伴隨有細胞內氧化應激增加，從而促進細胞內炎癥的發展和癌癥信號通路的激活。因此，在臨床上應用仙鶴草治療肝纖維化患者，不僅可起到減輕肝纖維化程度、阻止疾病進展的作用，還可起到防癌、減毒的功效。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法，對仙鶴草可能的靶點進行預測、分析，對這些靶點作用的生物學功能及信號通路進行分析，通過構建化合物-靶點-信號通路網絡圖分析了仙鶴草多成分、多靶點與肝纖維化之間的復雜網絡關系，通過實驗初步驗證了仙鶴草抗肝纖維化的部分藥理學作用，探索了可能的作用機制，對進一步深入探討仙鶴草抗肝纖維化作用機制提供了重要線索。后續將通過動物模型對上述機制研究進行體內實驗的驗證。

利益沖突聲明：無。

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（2021-02-18收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項目：重大疑難疾病中西醫臨床協作試點項目（國中醫藥辦醫政發〔2018〕3號-重慶）；成都中醫藥大學第二批醫院專項“杏林學者”學科人才科研提升計劃（YYZX20180040）；重慶市科研機構績效激勵引導專項基金（jxyn2020-4）；重慶市技術創新與應用發展專項重點項目（cstc2019jscx-dxwtBX0023）作者簡介：李麟（1988.06—），女，博士，主治醫師，研究方向：肝纖維化、肝癌中西醫治療，E-mail：lilin515626@126.com