ARHGAP23與非小細胞肺癌免疫浸潤和預后的相關性分析

王作培 曹磊 陸熠 丁一

肺癌的發病率和死亡率高,60%患者初次診斷時已有遠處轉移,5年生存率僅15%,總體預后差[1]。腫瘤組織中細胞突變的位點很少,與基因表達調控密不可分[2],故篩選出普適性高的標志物和治療靶點是肺癌早期預防、診斷、治療和預防復發的根本。ROCK(Rho-associated protein kinase,Rho相關蛋白激酶)是治療心血管疾病、代謝紊亂和腫瘤的潛在治療靶標[3-4],其Rho GTPase(Rho GTP酶)的活化受到Rho GAPs(Rho GTPase activating proteins,Rho GTPase活化蛋白)的調節[5]。本研究涉及的ARHGAP基因負責Rho GAPs的翻譯[6]?，F對我院2017年1月到2020年1月非小細胞肺癌手術患者的腫瘤標本進行免疫組化分析,使用TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)數據庫等檢測ARHGAP23表達,分析患者生存曲線,并探討ARHGAP23與免疫細胞浸潤的關系。

資料與方法

一、研究對象

選取上海市浦東新區人民醫院2017年1月到2020年1月接受手術治療且術后石蠟病理診斷為非小細胞肺癌的86例患者病理組織標本。其中男性41例(47.7%),女性45例(52.3%);年齡≤60歲49例(57.0%),>60歲37例(43.0%);收集的標本與數據經上海市浦東新區人民醫院倫理委員會批準(醫學倫理審查申請表編號2019-09)。納入標準:a) 年齡大于18歲,非妊娠期及哺乳期女性;b) 經病理診斷確診為非小細胞肺癌;c) 未經任何放射或化學治療。排除標準:臨床信息(總生存時間及生存狀態)不完整的患者。

二、研究方法

1 臨床資料隨訪

病例納入時間起點為2017年1月1日,納入終點是2020年1月1日,總生存期(overall survival,OS)定義為從手術日期到死亡或最后一次隨訪的時間。病例經門診途徑復診或經電話/微信隨訪。隨訪間隔為:術后前2年期間,每3個月復查一次;術后第3年,每半年復查一次;術后3年以后,每年復查1次。2022年1月1日對病例進行最終研究結局的隨訪。本研究隨訪主要目的是ARHGAP23表達量高低對非小細胞肺癌預后的影響,其次為臨床病例資料與患者的OS之間的關系。

2 免疫組化分析

借助免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidin-perosidase,SP)兩步法實施染色操作,組織切片放置在60℃的環境中進行烤片,時間為2小時,把組織切片浸潤到提前加熱處理過的修復液中,時間為15分鐘。使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)進行沖洗,然后添加內源性過氧化物酶阻斷劑進行孵育,時間為10分鐘。使用PBS進行沖洗處理,用濃度為1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)進行封存處理,添加兔抗人ARHGAP23多克隆抗體,該抗體是由Abcam公司提供的,放在37℃的環境中進行孵育,時間為60分鐘。添加辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG,放在室溫下進行孵育,時間為20分鐘,使用PBS進行沖洗,前后沖洗三次,二氨基聯苯胺法(dab color rendering,DAB)顯色。用PBS溶液對切片進行沖洗,使用蘇木精對細胞核進行復染,分化、沖洗返藍。用酒精進行脫水處理,用中性樹膠進行封存,放在顯微鏡下觀察,并用照片形式保存下來。

3 免疫組化結果判斷

(1)參考陽性細胞百分比開展計分工作:≤5%記作0分,6%～25%記作1分,26%～50%記作2分,51%～100%記作3分。(2)參考陽性細胞的染色強度開展計分工作:未著色記作0分,淡黃色記作1分,棕黃色記作2分,棕褐色記作3分。把上述數據相乘:≥3分記作高表達,<3分記作低表達。

4 基因表達分析

檢索TIMER數據庫得到不同癌癥或特異性癌癥亞型的腫瘤組織與鄰近正常組織之間ARHGAP23的表達差異。在數據庫中沒有正常對照組織或沒有腫瘤組織的情況下,借助GEPIA2網站和GTEx數據庫得到相關腫瘤組織和正常組織表達能力不同之處的箱線圖。參數設置為:P-value cutoff=0.05,log2FC cutoff=1。 綜合考慮UALCAN數據庫以及臨床數據,對每百萬轉錄本的值進行科學的預測和計算,借助 Log2(TPM+1) 表現出來,繪制了在 TCGA 數據庫中不同腫瘤患者中ARHGAP23表達水平的箱線圖。

5 生存預后分析

用Kaplan- Meier Ploter數據庫分析上述TCGA 數據庫的所有腫瘤中ARHGAP23的OS和無病生存期(disease free survival,DFS)數據。選擇合適的表達閾值以區分高表達人群和低表達人群 (Cutoff-High=50;Cutoff-Low=50) ,假設檢驗采用log-rank檢驗,并通過GEPIA2的“生存分析”模塊獲得單基因生存分析圖 (Kaplan- Meier曲線)。

6 基因變異分析

使用cBioportal(http://cbioportal.org)工具收集所有TCGA腫瘤ARHGAP23基因結構的突變頻率、突變類型、突變位點信息和拷貝數變化。

7 ARHGAP23相關基因富集分析

借助String數據庫了解、篩選蛋白質名稱和種類,這里選擇的是ARHGAP23和人,然后最低關系分數設置為高可信度0.700,交互對象的最高值不得高于50,這些信息是在試驗探究中獲得的。最后篩選得到了10個實驗確定的與ARHGAP23相互作用蛋白。

8 免疫浸潤分析

選取TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/) LUADLUSC(肺癌)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據,通過數據轉化和過濾,分析了ARHGAP23的表達與免疫浸潤的關系,免疫浸潤算法:ssGSEA (GSVA包內置算法),數據以氣泡圖、分組比較圖和散點圖的形式展現。

9 臨床相關性分析

下載(TCGA) LUADLUSC(肺癌)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據和臨床數據,通過轉化和過濾,分析了ARHGAP23的表達與臨床的相關性,R包主要為 ggplot2,數據以箱式圖和基線資料表形式展現。

三、統計學方法

借助SPSS 23.0、GraphPrism 6.0軟件實施統計分析,借助χ2檢驗比較分類變量之間的差異,連續變量采用t檢驗和趨勢檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier法,采用Cox比例風險模型對預后因素進行多因素分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、ARHGAP23在肺癌組織中的表達與生存率的關系

使用免疫酶標SP法進行免疫組化測定,結果顯示46例患者(53.5%)的腫瘤組織表現出高水平ARHGAP23表達,40例患者(46.5%)腫瘤組織表現出低水平ARHGAP23表達(圖1A)。利用臨床數據分析ARHGAP23的表達與非小細胞肺癌受試者存活率的相關性并做出Kaplan-Meier曲線。從K-M曲線可以看到,與低表達組相比,ARHGAP23高表達組的非小細胞肺癌患者存活率顯著升高(P<0.001)(圖1B)。

圖1 ARHGAP23肺癌組織中的表達和生存預后

二、ARHGAP23在肺癌組織中的表達與患者的臨床數據的相關性

以年齡大小、性別、腫瘤大小、是否吸煙、腫瘤分化情況為依據,把86例非小細胞肺癌病人的臨床特征進行分組,比較高表達組與低表達組間的差異,發現在腫瘤大小、淋巴結轉移和腫瘤分期上,組間差異有明顯統計學意義,而在年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化程度上,兩組間無明顯統計學差異(見表1)。

三、影響患者預后的Cox多因素分析

單因素分析結果顯示,腫瘤大小、淋巴結轉移和腫瘤分期是非小細胞肺癌患者預后的影響因素(P<0.05)。以是否存活為因變量,上述因素為自變量,進行Cox多因素分析,結果顯示腫瘤大小、淋巴結轉移和腫瘤分期是影響患者預后的獨立因素(P<0.05)(見表2)。

四、基因表達分析結果

首先分析ARHGAP23在各種惡性腫瘤和正常組織中的表達情況,檢索TIMER數據庫發現,ARHGAP23在乳腺癌(BRCA),腦癌(GBMLGG),嫌色細胞癌(KICH),肺腺癌(LUAD),子宮內膜癌(UCEC)組織中的表達水平明顯低于正常水平(P<0.05),在膽囊癌(CHOL),食管癌(ESCA),肝癌(LIHC),甲狀腺癌(THCA)組織中的表達顯著高于正常組織(P<0.05)(圖2A) 。將TCGA數據庫中缺少正常組織對照的腫瘤聯合GTEx數據庫進一步評估分析發現,ARHGAP23在皮膚癌(SKCM)、睪丸癌(TGCT)中的表達水平明顯低于正常組織(P<0.05),而在淋巴癌(DLBC)和胸腺瘤(THYM)的表達水平顯著高于正常組織(P<0.05)(圖2B)。CPTAC數據集的結果顯示,ARHGAP23總蛋白在乳腺癌(BRCA)、卵巢癌(OV)、透明細胞癌(RCC)、子宮內膜癌(UCEC)和肺腺癌(LUAD)的原發組織中的表達高于正常組織(圖2C)。通過HEPIA2的“病理分期圖”模塊觀察ARHGAP23表達與腫瘤病理分期的相關性,包括COAD,食管癌(ESCA),腎透明細胞癌(KIRC) 和子宮內膜癌(UCEC)(P<0.05,圖2D),其他腫瘤的ARHGAP23表達與病理分期無明顯相關性。

五、生存預后分析結果

為了評估 ARHGAP23與腫瘤預后的關系,參考ARHGAP23的表達情況,把腫瘤病例分成兩部分:一部分是高表達組;一部分是低表達組,借助TCGA和GEO計算分析不同腫瘤病人預后的相關性,相關結果(見圖3A),高表達的ARHGAP23與LGG(P=0.001)、OV(P=0.019)、PAAD(P=0.015)和SKCM(P=0.022)患者的總OS(生存率)的不良預后相關。DFS(無病生存期)分析數據(圖3B)顯示,在LGG(P<0.001)和PAAD(P<0.001)之間存在相關性。

表1 非小細胞肺癌患者臨床特征與ARHGAP23的表達[n(%)]

圖2 ARHGAP23基因在不同腫瘤和病理階段的表達水平

六、基因改變分析結果

癌癥的發展是由于基因突變的積累,在TCGA數據庫的不同腫瘤樣本中分析ARHGAP23的基因變異情況。(如圖4A)所示,大部分腫瘤沒有基因突變,只有在UCEC和ESCA中,ARHGAP23的改變頻率比較高,其改變的類型、位點和病例數進一步(見圖4B),我們發現在該結構域Tudor的R918H/X918存在突變。

表2 影響患者預后的Cox多因素分析

圖3 ARHGAP23基因表達與腫瘤生存預后的相關性 在TCGA中,借助GEPIA2工具和ARHGAP23基因表達對TCGA中多種腫瘤實施A:總生存率;B:無病生存期研究探討,進而得到陽性結果的生存圖和Kaplan-Meier曲線

七、富集分析結果

為了研究ARHGAP23在腫瘤發生發展中的分子機制,篩選出已知的與 ARHGAP23相互作用蛋白和ARHGAP23表達相關基因。使用 String數據庫,總共獲得了10個與ARHGAP23相互作用的蛋白質,(圖5A)展現10種蛋白質的影響關系網絡。

八、免疫浸潤結果

選取TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/) LUADLUSC(肺癌)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據,通過數據轉化和過濾,分析ARHGAP23的表達與免疫浸潤的關系,結果顯示:在肺癌中ARHGAP23與Tcm,NK CD56 dim 細胞和NK 細胞存在正相關關系,ARHGAP23與Th17 細胞和CD8+T細胞等免疫細胞存在負相關關系(圖5B),ARHGAP23的高表達跟T細胞浸潤呈負相關(圖5C,D)。

圖4 ARHGAP23在TCGA不同腫瘤中的變異分析我們使用cBioPortal tool分析了ARHGAP23的變異特征。A圖顯示突變類型;B圖顯示突變位點

九、臨床相關分析結果

對TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/) LUADLUSC(肺癌)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據和臨床數據進行轉化和過濾,分析了ARHGAP23的表達與臨床的相關性,結果顯示:肺癌中T3高于T1的平均水平,兩組的差值為0.363(0.028～0.697),差異具有統計學意義(P=0.028)(圖6A),高表達ARHGAP23的III期肺癌患者預后更好(圖6B)。

討 論

人類ARHGAP23基因位于17號染色體[7],負責編碼RhoGAPs家族蛋白。在肺癌的發生發展中,Rho GAPs通過磷酸化激活Rho GTPase,影響多種下游靶蛋白,促進蛋白質合成、細胞增生、細胞質分裂、肌動蛋白網絡形成以及肌動球蛋白的收縮等進而實現多種細胞功能[8-10]。研究發現,ARHGAP在多種腫瘤中顯著下調。腸癌中發現ARHGAP30是p53乙?；凸δ苄约せ畹囊粋€至關重要的調控因子,在DNA損傷應激情況下,ARHGAP30表達是p53激活的必要條件[11];ARHGAP7(DLC-1)的泛素化降解機制導致了Rho A信號通路的激活促進了肺癌的增殖[12];GWAS分析發現ARHGAP23的SNP位點可能與卵巢癌的發生相關[13]。

本研究分析了86例非小細胞肺癌患者腫瘤組織的ARHGAP23表達,并利用臨床數據分析ARHGAP23的表達與患者存活率的Kaplan-Meier曲線。結果表明ARHGAP23高表達組的非小細胞肺癌患者存活率顯著升高。通過生物信息學數據庫對ARHGAP23進行泛癌分析,結果表明ARHGAP23在不同腫瘤中表達量有較大差異,與臨床預后、免疫浸潤之間存在統計學相關性。

免疫細胞主要包括NK細胞、T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等[14-15],在腫瘤組織中浸潤后形成腫瘤微環境。在腫瘤微環境中,不同的細胞類型對腫瘤的作用不同。通常情況下,CD4+輔助T細胞、NK細胞、M1型巨噬細胞能夠殺死腫瘤細胞,但是 M2型巨噬細胞、CD4+FoxP3+Th2輔助T細胞、髓源性抑制細胞能夠對腫瘤細胞免疫逃逸起到積極影響[16],所以腫瘤微環境的免疫逃逸機理及免疫治療手段在臨床醫學上有著不可忽視的價值[17]。經過浸潤處理的免疫細胞對免疫治療反應和腫瘤預后有著極為關鍵的影響,而且有可能成為免疫治療藥物重要靶點[18]。

圖5 ARHGAP23相關基因富集分析

圖6 ARHGAP23在TCGA數據庫中肺癌數據集的臨床相關性分析

腫瘤細胞的免疫應答主要有兩種:一種是天然性,另一種是獲得性。在獲得性免疫應答中,CD8+T細胞發揮著極其關鍵的作用,能夠過繼抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL),起到殺滅腫瘤細胞的作用[19];但是NK細胞是人體天然免疫體系中不可或缺的一部分,不用提前致敏就可以消除腫瘤細胞,而且沒有無腫瘤特異性和MHC限制性,是人體防范腫瘤疾病的第一個屏障[20]。機體在與腫瘤對抗的過程中,自身免疫系統通過免疫浸潤,在患者體內起到了至關重要的作用。研究表明,腫瘤浸潤的各種免疫細胞與患者預后相關,并在腫瘤免疫逃逸、抗腫瘤等方面發揮不同的作用[21]。淋巴細胞(CD8+、CD4+、調節性T細胞等)在抗腫瘤免疫監視中具有重要的作用。Ruffini等[22]研究表明,有25%肺癌組織中可觀察到淋巴細胞浸潤,并在微血管浸潤和低分化的腫瘤中比例較高。Mori等[23]研究發現,腫瘤的組織類型和分化程度與CD8+T細胞的浸潤程度和數量有關。這表明免疫細胞的反應與腫瘤分化程度呈正相關。在非小細胞肺癌中,低分化腫瘤可能表達更多的腫瘤相關抗原,導致強烈的免疫反應如淋巴細胞浸潤等。而NK細胞在抗腫瘤過程中所起的作用有不同的結論。Takanami等[24]認為,NK細胞主要分布在腫瘤基質中,特別是存在于腫瘤-基質交界,其浸潤可能和腫瘤演進的調節有關。

因為CD8+T細胞和NK細胞在腫瘤免疫中的職能不一樣,本文把這作為入手點,分析探討ARHGAP23在非小細胞肺癌中的表達與免疫細胞浸潤之間的內在機理。通過分析TCGA數據庫中的RNAseq數據發現,ARHGAP23在肺癌細胞中的表達與Tcm細胞,NK CD56 dim細胞和NK細胞存在正相關關系,而與Th17 細胞和CD8+T細胞等存在負相關關系。該結論符合前述研究結果,并提示ARHGAP23可能通過正向調節NK細胞分泌大量細胞因子,從而起到抗腫瘤作用。

本研究通過生物信息學分析發現NK細胞浸潤與ARHGAP23的表達呈正相關,但對肺癌患者按照年齡、性比、腫瘤大小、吸煙史、腫瘤分化程度、淋巴結轉移和腫瘤分期等進行分組,比較高表達組與低表達組間的差異,發現在腫瘤大小、淋巴結轉移和腫瘤分期上兩組間差異有明顯統計學意義,而腫瘤分化程度在兩組間卻沒有看到明顯的統計學差異。為了明確ARHGAP23與免疫浸潤的關系,后續還需要更多的細胞功能學實驗和動物實驗,加大樣本量及數據分層,以更深入探究ARHGAP23與非小細胞肺癌免疫浸潤之間的關系。