哮喘中miRNA、lncRNA、circRNA、轉錄因子和靶基因的調控網絡

李昱劍，闞璇

（天津醫科大學總醫院兒科，天津 300070）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是臨床最常見的慢性氣道炎癥性疾病之一。哮喘復雜的發病機制和多樣化的臨床表現既增加了臨床醫生的診治難度，也使患者在日常生活中飽受痛苦[1]。目前全球至少有3 億哮喘患者，且哮喘的發病率在全球范圍內仍呈上升趨勢[2]。雖然隨著醫學進步，既往統計的哮喘死亡率已經有所下降，但從2006 年開始其下降趨勢就出現了急剎車，表明現有治療手段已經遇到了瓶頸[3]。

越來越多疾病的診治從蛋白質水平進入到了轉錄和調控水平，其中非編碼RNA 發揮著不可替代的作用[4]。研究表明，與健康人相比，哮喘患者外周血樣本中lncRNA 的數量和表達存在差異[5]。與傳統的線性RNA 不同，circRNA 呈現封閉的環狀結構，使其表達更加穩定。circRNA 可以通過與哮喘等疾病相關的miRNA 相互作用，從而對哮喘等疾病的發生、發展起到重要作用[6]。轉錄因子是一組蛋白質分子，能使目標基因在特定的時間和空間上以特定的強度進行表達。一些研究也指出，轉錄因子可以參與哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和免疫調節[7]。

近年來，有關miRNA 與哮喘關系的研究層出不窮，對哮喘的診治起到了積極的推動作用，但關于lncRNA、circRNA、轉錄因子等非編碼RNA 與哮喘關系的研究仍有較多空白。本研究將使用上述方法篩選哮喘的DEGs，并構建miRNA、lncRNA、circRNA、轉錄因子和靶向藥物與哮喘靶基因之間的調控網絡。對哮喘相關的遺傳物質、功能、通路和靶向藥物的探索，可以為哮喘生物標志物挖掘和精準醫療提供參考。

1 材料與方法

1.1 微陣列數據 本研究使用檢索式：（′asthma′[MeSH Terms] OR ′asthma′[All Fields]）AND（′Homo sapiens′[Organism]AND′Expression profiling by array′[Filter]）從GEO[8]（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/geo/）數據庫中篩選出了GSE43696 和GSE64913 這兩個數據集，并從中提取了相應的臨床信息。GSE43696來源于GPL6480 平臺（Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F），包含88 例哮喘患者的支氣管上皮細胞樣本和20 名健康人體樣本[9]。GSE64913 來源于GPL570 平臺（[HG-U133_P lus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array），包含15 例哮喘患者的支氣管上皮細胞樣本和19 名健康人體樣本[10]。

1.2 識別差異表達基因 通過核對兩個數據集的信息來平均或刪除沒有相應基因符號的探針組和有多個探針組的基因。使用R 軟件的Limma 包（版本：3．40．2）去除批次效應并識別DEGs。以“P＜0．05 and/Fold Change/＞1．5”作為篩選DEGs 的閾值。

1.3 GO 和KEGG 富集分析 R 軟件中的Cluster－Profiler 包（版本：4．0）被用于GO 和KEGG 富集分析。箱式圖由ggplot2 包繪制；PCA 圖由ggord 包繪制；熱圖由pheatmap 包繪制。上述所有分析方法和R 軟件包均由R 軟件（2020）4．0．3 版完成。

1.4 Metascape 使用Metascape[11]（http：//metascape．org/）對得到的DEGs 再次進行GO 和KEGG 富集分析，與ClusterProfiler 包分析得到的結果進行對比驗證和互相補充，使最終結果更加真實可靠。篩選條件：Min Enrichment=1．5，P＜0．01 and Min overlap=3。

1.5 WEB－based GEneSeTAnaLysis Toolkit（WebGestalt）數據庫和Reactome Pathway 數據庫 使用WebGestalt[12]（http：//www．webgestalt．org/）和Reactome[13]（https：//reactome．org/）數據庫對DEGs 從另一種算法角度進行GO 和KEGG 富集分析，從而補充單一算法的不足。WebGestalt 數據庫的篩選標準是Number of IDs in the category：5－2000，FDR Method：BH，and Significance Level：FDR＜0．05。Analysis Tools是Reactome 數據庫中的一個分析工具，被用于通路研究。

1.6 蛋白－蛋白交互網絡構建與靶基因篩選 使用STRING[14]（https：//string－db．org/）數據庫構建DEGs的蛋白－蛋白交互網絡，minimum required interaction score=0．4 被認為具有統計學意義。使用Cytoscape 對蛋白－蛋白交互網絡進行可視化[15]，并使用Cytoscape 的插件Cytohubba 篩選出最重要的9個核心基因。

1.7 lncRNA－miRNA－靶基因相互作用網絡分析在Tarbase[16]（http：//carolina． imis．athena－innovation．gr/diana_tools/web/index．php?r=tarbasev8%2Findex）和TargetScan[17]（http：//www．targetscan．org/vert_80/）數據庫中，使用評分最高的4 個核心基因預測可能的miRNA，并通過取交集的方法降低結果的偶然性，從而得到可靠性最高的miRNA。使用ENCORI[18]（https：//starbase．sysu．edu．cn/）預測與miRNA 相匹配的lncRNA，并使用LncBase[19]（http：//carolina．imis．athena－innovation．gr/diana_tools/web/index．php?r=lncbasev2%2Findex－experimental）進行驗證，從而構建出最可靠的lncRNA－miRNA－靶基因相互作用網絡。

1.8 circRNA－miRNA－靶基因相互作用網絡分析 使用與1．7 相同的方法預測篩選可以與9 個靶基因相匹配的miRNA。使用ENCORI 數據庫預測與miRNA 匹配的circRNA，并使用circad 數據庫[20]（https：//clingen．igib．res．in/circad/）進行臨床驗證。

1.9 轉錄因子－miRNA－靶基因相互作用網絡分析 使用AnimalTFDB[21]（http：//bioinfo．life．hust．edu．cn/AnimalTFDB/）預測得分最高的4 個基因所對應的轉錄因子，并使用JASPAR[22]（https：//jaspar．genereg．net/）對得到的轉錄因子進行二次驗證，以提高結果的可靠性。最終，每個靶基因篩選出了2 個評分最高的轉錄因子，篩選標準：Strand：+，P-value＜0．05 and Q-value ＜0．05。

1.10 The Drug Gene Interaction（DGIdb）數據庫 DGIdb[23]（http s：//www．dgidb．org/）被用于預測9 個靶基因的潛在靶向藥物。篩選標準：Source Databases=22，Gene Categories=43，Interaction Types=31。

1.11 臨床意義驗證 提取GSE41649 數據集中的臨床信息后，分別借助pROC 包和ggplot2 分析評分最高的4 個核心基因對哮喘的疾病預測能力和差異表達情況。

2 結果

2.1 哮喘差異表達基因的識別 使用R 軟件的Limma 包（版本：3．40．2）對GSE43696 和GSE64913數據集的信息進行標準化和去批次效應后，共得到76 個DEGs，其中44 個基因上調，32 個基因下調（P＜0．05 &/Fold Change/＞1．5）。數據標準化后的箱式圖、去批次前/后的PCA 圖、DEGs 的火山圖、熱圖及DEGs 中的特定基因如圖1 所示。

圖1 哮喘差異表達基因的識別Fig 1 Identification of differentially expressed genes in asthma

2.2 GO 和KEGG 富集分析 使用R 軟件的ClusterProfiler 包（版本：4．0）以及Metascape、WebGestalt 和Reactome 對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析并可視化（圖2、3）。GO 富集分析顯示，DEGs在淋巴細胞趨化、器官或組織特異性免疫反應、有機羥基化合物運輸、細胞殺傷、黏膜免疫反應、抗菌體液反應、內吞調節等方面明顯富集。KEGG 富集分析表明，DEGs 主要參與白細胞介素－17 信號通路、抑制一氧化氮產生、激活C3 和C5、果糖和甘露糖代謝等方面。

圖2 上調和下調的差異表達基因的GO 和KEGG 富集分析Fig 2 Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）enrichment analysis of up-regulated genes and downregulated genes

圖3 差異表達基因的GO 和KEGG 富集分析Fig 3 Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 蛋白－蛋白交互網絡構建與靶基因篩選 使用Cytoscape 對STRING 構建的蛋白－蛋白交互網絡進行可視化，共有43 個節點和54 條邊（圖4A）。通過Cytohubba 使用11 種方法來識別DEGs 中的核心基因，MCC 展現出了更好的比較性能。最終得到了9個評分最高的DEGs，它們分別是CLCA1、POSTN、CPA3、LTF、PIP、FKBP5、CCL26、SERPINB2 和 KIT（圖4B）。在這9 個核心基因中，LTF 和PIP 在哮喘患者中低表達，其余基因均為高表達。

圖4 蛋白-蛋白交互網絡Fig 4 Protein-protein interaction network

2.4 lncRNA－miRNA－靶基因相互作用網絡分析 評分最高的4 個核心基因分別是CLCA1、POSTN、CPA3 和LTF。Tarbase 和TargetScan 數據庫預測到了67 個miRNA，其中hsa-miR-19b-3p 是兩個數據庫取交集后的公共結果。使用ENCORI 預測可能與hsa-miR-19b-3p 相互作用的lncRNA，并通過LncBase 驗證結果。最終共得到7 個最可靠的lncRNA（ENSG00000272264、ENSG00000270087、ENSG00000245532、ENSG00000275764、ENSG0000-0263753、ENSG00000229807 和ENSG00000230590），并通過Cytoscape 對結果進行了可視化（圖5A）。

圖5 lncRNA/circRNA-miRNA-靶基因的相互作用網絡Fig 5 The lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA interaction network

2.5 circRNA-miRNA-靶基因相互作用網絡分析 共有158 個miRNA 被預測到，最終篩選保留了2 個最可靠的miRNA（hsa-miR-19b-3p 和hsa-miR-218-5p）。使用ENCORI 預測可能與以上2 個miRNA相互作用的circRNA，共得到1 314 個circRNA。借助Circad 數據庫驗證預測得到的circRNA 的臨床信息，最終確認SNX13 是與哮喘相關的circRNA（圖5B）。

2.6 轉錄因子-miRNA-靶基因相互作用網絡分析 用AnimalTFDB 預測評分最高的4 個核心基因所對應的轉錄因子，用JASPAR 對結果進行驗證。最終，每個核心基因篩選出了2 個最可靠的轉錄因子。它們分別是SPI1、RREB1、AR、BCL6、IRF5、ZNF143、MAZ 和PAX5。轉錄因子-miRNA-靶基因相互作用網絡見圖6A。

圖6 轉錄因子-靶基因-miRNA 的相互作用網絡與藥物-靶基因的相互作用網絡Fig 6 Transcription factor-mRNA-miRNA interaction network and drug-mRNA interaction network

2.7 哮喘的靶向藥物 使用DGIdb 預測9 個靶基因的潛在靶向藥物，共得到了91 種藥物，這些藥物有可能干預哮喘DEGs 的表達（圖6B）。評分最高的4 個核心基因中有2 個預測到了潛在的靶向藥物或分子化合物。CLCA1 的靶向藥物是他尼氟酯，LTF的潛在靶向藥物或分子化合物分別是α-苯丙氨酸轉鐵蛋白、帕瑞昔布、巴比妥珠和雷瑟平。此外，相互作用評分最高的藥物——尿激酶被發現與SERPINB2 存在相互作用。預測到靶向藥物或分子化合物最多的靶基因是KIT，它共有72 種靶向藥物或分子化合物。

2.8 臨床意義驗證 ROC 曲線顯示，評分最高的4 個hub 基因中，CLCA1、POSTN 和LTF 對哮喘均具有較高的疾病預測能力，而CPA3 同樣具有中等的疾病預測能力（圖7A~7D）。分組比較圖顯示CLCA1、POSTN 和LTF 在新的臨床數據中同樣存在表達差異，其中CLCA1 和POSTN 在哮喘中高表達，LTF 在哮喘中低表達（圖7E~7H）。

圖7 核心基因的ROC 曲線和分組比較圖Fig 7 ROC curves and grouping comparison plots for hub genes

3 討論

哮喘的發病機制復雜，在診斷和精準醫療方面仍存在諸多不足。傳統治療藥物如糖皮質激素等的治療周期長、依從性差，治療效果并不足夠理想，而奧馬珠單克隆抗體等生物制劑的安全性和經濟負擔讓很多患者及家屬感到擔憂[24]。本研究構建了miRNA、lncRNA、circRNA、轉錄因子、靶向藥物和靶基因的調控網絡，從而為哮喘相關生物標志物的探索提供一定的參考依據，對哮喘患者和有潛在風險者的早期識別、早期診斷和早期治療有一定的臨床價值。

本研究通過對GSE43696 和GSE64913 這2 個數據集的分析，得到了44 個在哮喘中高表達的DEGs 和32 個低表達的DEGs。GO 分析顯示DEGs 的功能主要富集在先天免疫、獲得性免疫和炎癥的發生、發展上，尤其是細胞殺傷、內吞作用的調節和淋巴細胞趨化作用等方面。既往研究表明，一些哮喘相關基因可以促進氣道炎癥，并在炎癥體的幫助下誘發哮喘的發生。此外，既往感染引起過敏原特異性免疫功能的過早表達，對哮喘的發生、發展也有一定作用[25]，這與本研究的結論一致。通路富集的結果顯示，趨化因子信號通路、激素和有機物代謝通路和免疫調節通路在DEGs 中具有較好的富集結果，說明哮喘的發生發展與免疫、微生物、炎癥以及有機物代謝密切相關，提示可以從這些角度對哮喘的診斷和治療進行早期干預。

在構建DEGs 的蛋白-蛋白交互網絡后，共篩選出了9 個靶基因，其中LTF 和PIP 在哮喘患者中低表達，其余為高表達。4 個核心基因，即CLCA1、POSTN、CPA3 和LTF 的篩選評分最高。CLCA1 的全稱是氯通道附屬物1，可以調節鈣激活的氯離子傳導，產生分泌蛋白和膜相關蛋白，這些蛋白可以增加白細胞浸潤和氣道高反應性，從而增加哮喘的易感性[26]。POSTN 是骨膜蛋白，它在轉化生長因子-β 和白細胞介素-13 的作用下產生。據報道，在哮喘患者的呼氣冷凝物中可以檢測到骨膜蛋白，且POSTN 高表達的患者肺功能相應下降，表明POSTN 有被用作生物標志物的可能性[27]。CPA3 的全稱是羧肽酶A3，有報道稱該基因與哮喘、冠心病、COVID-19 等有關，原因可能是該酶可參與巨噬細胞的激活和促炎癥細胞因子的上調，從而直接或間接參與炎癥和免疫調節[28]。LTF（乳鐵蛋白）是轉鐵蛋白家族基因的一員，其蛋白產物是免疫系統的重要組成部分，然而遺憾的是目前還沒有發現這個基因與哮喘發生和發展之間的具體關系。本研究篩選得到的這些基因具有作為哮喘診治靶基因的巨大潛力。

Has-miR-19b-3p 和hsa-miR-218-5p 是通過不同的數據庫和算法最終篩選得到的2 個miRNA。既往研究顯示，hsa-miR-19b-3p 可能在哮喘的發生和發展中發揮潛在作用[29]。Hsa-miR-218-5p 是由KIT 預測得到的，同樣有文獻表明它可能在嗜酸性粒細胞氣道炎癥中起到保護作用[30]。在miRNA 的基礎上，共篩選得到了7 個lncRNA 和1 個circRNA，最終構建了miRNA、lncRNA、circRNA 和靶基因的表達調控網絡，為哮喘診斷的進一步研究和精準醫療提供了依據。

共篩選得到了8 個轉錄因子，它們在炎癥、細胞增殖和分化、免疫調節、生長發育等方面發揮著重要作用[31-32]，有被用作哮喘治療標志物的可能性。此外，靶向藥物的預測顯示CLCA1 的靶向藥物他尼氟酯是一種非甾體類抗炎藥，可用于纖維囊腫和哮喘的輔助治療[33]。LTF 的潛在靶向藥物或分子化合物分別是α-苯丙氨酸轉鐵蛋白、帕瑞昔布、巴比妥珠和雷瑟平，它們在治療哮喘方面的作用尚不清楚。交互得分最高的靶向藥物尿激酶主要作用于內源性纖維蛋白溶解系統，它也可能與哮喘的治療有關[34]。此外，靶基因KIT 共預測到了72 種靶向藥物，這些藥物同樣可能為哮喘的治療提供一個新的方向，所以值得進一步研究和探索。

本研究使用了2 個去批次效應后的數據集來增加樣本量，并使用了1 個新的數據集驗證最終的結果，從而使本文結論更加可靠。此外，本研究還預測了與哮喘有關的轉錄因子和藥物，這使本研究比以往的研究更加全面和廣泛。本研究同樣存在一些局限性。首先，雖然使用了多個數據庫和不同算法取交集的方法來提高結果的可靠性，但仍缺少體內體外實驗對通路和機制進行進一步驗證，后續可以從實驗驗證等方面對本文的研究結果進行更加深入的分析研究。此外，本研究的數據來自于公共數據庫，缺少外部數據進行驗證，因此存在假陽性的可能性，后續可以使用更高質量的外部數據進行前瞻性研究與本文結果進行互相佐證從而降低假陽性率。

綜上所述，本研究共識別出了76 個DEGs，并從中篩選出了9 個靶基因。細胞殺傷、調節內吞作用、淋巴細胞趨化等生物功能和趨化因子信號通路、免疫調節通路等通路都在哮喘的發生、發展中起到一定的作用。SNX13 和7 個lncRNA 通過hsa-miR-19b-3p 和hsa-miR-218-5p 參與哮喘相關基因的表達和調控。此外SPI1 等轉錄因子和他尼氟酯等藥物同樣可能會干預哮喘相關基因的表達調控。