無毛青藤葉綠體基因組解析及系統發育分析

趙文植，楊琳懿，曹正英，辛 靜，馬路遙，王 飛，李衛英，辛培堯

（西南林業大學 a. 國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心；b. 西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224）

青藤屬Illigera為常綠藤本植物，主要分布于亞洲熱帶和非洲南部地區。在我國主要分布于云南、貴州、福建等地，占據了約全球30 個種中的2/3 以上。無毛青藤產于云南西部，莖紫褐色，光滑無毛，與小花青藤十分相似[1]。青藤屬植物在中國自然分布的野生資源十分豐富，這也客觀上為該屬的研究提供了大量的天然資源。青藤屬植物大多具有止痛消腫、活血化瘀的功效[2]；藥效成分主要為生物堿、甾體和萜類化合物，這些化合物分別表現出細胞毒活性、抗凝血活性、抗血管腎上腺受體活性等[3]。廣西壯族居民常用其治療風濕類疾病[4]。

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近年來，對青藤屬植物的研究主要集中于地理分布與資源調查、生態生理、植株化學成分、藥理作用等方面[5-10]，而對該屬植物基因組方面的研究報道較少。在植物基因組中，葉綠體基因組由于結構較簡單，分子量較小，且分析技術手段較完善，所以更容易對其完整的基因組進行組裝。葉綠體是擁有獨立穩定基因組的半自主細胞器，具有高度的保守性且進化速率較慢，在不同物種間具有更好的統一性。因此，其基因組序列可用于鑒定物種、系統發育及轉基因等方面的研究[11-12]。在葉綠體基因組中，同義密碼子作為重要的氨基酸信息，存在著密碼子使用方面的偏好性，受較多因素的影響，對揭示物種基因組的進化關系以及轉葉綠體基因有著重要意義。而葉綠體基因組中的簡單重復序列（SSR）則會影響染色體的空間構象及編碼序列的表達。因此，該方面的研究有利于開發新的SSR 標記用作遺傳多樣性分析以及物種或品種的鑒定。相關研究已在羊躑躅Rhododendron molle[12]、杧果Mangifera indica[13]、蒜頭果Malania oleifera[14]、 裂葉榆Ulmus laciniata[15]等植物中有所報道，并為揭示相關植物的質體基因組結構特征提供了一定的理論基礎。

目前，有關青藤屬植物葉綠體基因組的研究大部分集中于使用葉綠體基因組片段和ITS 進行系統發育等分析，如Michalak 等[16]用葉綠體trnTtrnL、trnL-trnF和psbA-trnH基因間隔區重建蓮葉桐科的系統發育樹，結果顯示青藤屬、蓮葉桐屬Hernandia和楊樟屬Hazomalania聚為一支，但出現了平行枝，不能分辨其姐妹關系。Renner 等[17]用葉綠體rbcL基因和rnL-trnF基因間隔區對包括青藤屬在內的38 屬58 個物種進行系統發育分析，結果顯示青藤屬與蓮葉桐屬的親緣關系最近。目前，僅有3 個青藤屬植物的完整葉綠體基因組[18-19]有所公布?；谌~綠體全基因組構建青藤屬植物系統發育樹的研究還未見提及，而無毛青藤葉綠體基因組方面的研究也鮮有報道。以無毛青藤I. glabra為試驗材料，采用二代高通量測序技術對無毛青藤綠體基因組進行測序。將其與5 個近緣種（大花青藤I. grandiflora、紅花青藤I. rhodantha、小花青藤I. parviflora、寬藥青藤I. celebica和繡毛青藤I. rhodanthavar.dunniana）的葉綠體基因組進行比較基因組學和系統發育的研究，結果可為進一步探討青藤屬系統進化和遺傳多樣性等問題提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無毛青藤采自于云南省勐臘縣勐侖鎮（21.9170N，101.2713E；540 m），選擇并采集健康的葉片在液氮中速凍，然后存于-80 ℃冰箱中，以備后用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取及測序

1.2.4 密碼子偏好性分析

使用IRscope 軟件分析無毛青藤與其他5 種青藤的葉綠體基因組結構中四大分區的SC/IR 邊界擴張收縮情況；通過mVISTA 軟件，以無毛青藤葉綠體基因組為參照，并與另外5 種青藤植物進行比對分析。同時，對核酸變異情況利用DnaSP軟件[28]進行分析，并篩選出高變區。

測序完成后得到高質量clean reads。以紅花青藤（Gen-Bank 登錄號：MW755975）葉綠體基因組作為參考序列，使用Jin 等[21]設計的GetOrganelle軟件對無毛青藤的葉綠體基因組進行組裝，利用Geneious R8.1.3 軟件[22]進行基因組注釋。

隨著經濟的發展和木材需求量的增加，杉木純林已經不適應現代社會的發展需求。本文主要分析杉木純林和混交林方面的內容，重點分析了林下植物多樣性，得出如下結論：林下植物的多樣性指數會受到多因素影響，如物種豐富度、物種數、均勻度指數、植被類型、環境和人為干擾等；本文研究的杉木純林和混交林的林下植物多樣性同樣受環境因素的綜合影響，某些區域出現物種優勢度指數為1.000的情況，主要是因為某一物種在其中占有絕對優勢，完全限制了其他物種的生長。

1.2.6 無毛青藤cpDNA 序列的比較分析

采用BEIER 等[23]提出的方法，利用在線工具MISA-web（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php，由perl 程序運行）對無毛青藤葉綠體基因組中的SSR 進行識別。

采用CTAB 法[20]提取總DNA，并送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。

在植物進化的過程中，葉綠體基因組的IR 區和LSC 區、SSC 區的邊界一般會出現擴張或收縮現象，這是葉綠體基因組長度在不同被子植物中存在差異的重要原因，在植物葉綠體基因組的演化過程中具有重要作用[31-32]。經比較分析發現，6 個青藤屬植物葉綠體基因組變化的大小差異為1 477 bp，而LSC、SSC 與IR 4 個區域的差異大小表現為LSC（約711 bp）＞IR（789 bp）＞SSC（139 bp）。所以，整體基因組長度的差異基本上是由IR 區和LSC 區造成的。紅花青藤葉綠體基因組的結構與其他5 個種有較大的差異，這可能與其葉綠體基因組IR 區發生了收縮有關，同時也印證了不同植物的葉綠體基因組會由于IR 區的收縮和擴張而產生差異的說法[33]。在董溪等[34]的研究中，包括短葉黃杉Pseudotsuga brevifolia在內的16 個松科植物的trnH基因處于SSC/IRb 邊界且完全位于SSC 區，但在青藤屬植物中，trnH基因大部分位于LSC 區，且除紅花青藤外，均剛好位于IRa/LSC 邊界，這種現象可能與青藤屬植物葉綠體基因組IR 區發生了收縮有關。

在無毛青藤葉綠體基因組密碼子使用分析中發現，以A/U 結尾的Arg 密碼子被優先使用。共檢測到64 種密碼子，編碼20 種氨基酸（圖2）。我們檢測到33 個RSCU 值大于1 的簡并密碼子，2 個RSCU 值為1 的簡并密碼子，表明它們主要用于編碼無毛青藤中的某些氨基酸。在64 種密碼子中，使用偏好最強的是編碼Arg（精氨酸）的AGA 密碼子（RSCU 值為1.75），最低的是編碼精氨酸的CGC 密碼子（RSCU 值為0.47）。在20 種氨基酸中，Leu（亮氨酸）、Ser（絲氨酸）和Arg（精氨酸）使用了6 種密碼子；其次是Val（纈氨酸）、Pro（脯氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Ala（丙氨酸）和Gly（甘氨酸）各使用了4 種密碼子；Ile（異亮氨酸）和終止子使用了3 種密碼子；在20 種氨基酸中有9 種氨基酸僅使用2 種密碼子，分別為Phe（苯丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、His（組氨酸）、Gln（谷氨酰胺）Asn（天冬酰胺）、Lys（賴氨酸）、Asp（天冬氨酸）、Glu（谷氨酸）和Cys（半胱氨酸）；而 Trp（色氨酸）和Met（甲硫氨酸）僅使用1 種密碼子。除了蛋氨酸和色氨酸的密碼子外，所有的首選密碼子都以A/U 結尾，說明無毛青藤葉綠體基因組密碼子偏好使用A 或U 結尾的密碼子。

從NCBI 數據庫下載已公布的蓮葉桐科Hernandiaceae 蓮葉桐屬Hernandia蓮葉桐Hernandia nymphaeifolia（MG838431）完整的葉綠體基因組序列作為外類群，使用青藤屬5 個種及一個變種的葉綠體DNA 建立系統發育樹，利用MAFFT 軟件[25]進行序列比對，利用iqtree 軟件[26]對經人工檢查后的矩陣用ML 法進行系統進化樹構建及分析，選擇最佳模型TVM+F+I+G4，自展值Bootstrap 設為1 000[27]。

1.2.3 SSR 位點識別

3.A 提示:氨水的主要成分NH3·H2O是弱電解質,氫氧化鈉是強電解質,前者部分電離,后者完全電離,故通過室溫下測定等濃度氨水和NaOH溶液的pH,可比較氨水和NaOH堿性強弱,A項正確。由于NH3·H2O是弱堿,Al(OH)3不能溶于氨水中,故無法驗證Al(OH)3的酸性,B項錯誤。濃硫酸無揮發性,無法觀察到白煙,C項錯誤。NH4Cl受熱也會分解,故不可采用加熱法除雜,D項錯誤。

1.2.2 葉綠體全基因組的組裝、注釋

2 結果與分析

2.1 基因組基本特征

測序得到的無毛青藤葉綠體基因組全長為156 513 bp，GC 含量為39.1%。結構為典型的環狀雙鏈四分體結構，包括1 對反向重復區（IRs，26 254 bp）、1 個大單拷貝區（LSC，85 225 bp）和1 個小單拷貝區（SSC，18 779 bp）。4 個區段中，IR 區的GC 含量最高（43.3%），LSC 區GC 含量為37.7%，SSC 區最低。注釋無毛青藤葉綠體基因組共獲得131 個基因。其中，84 個位于LSC 區，SSC 區13 個，兩個IR 區各17 個，包括86 個編碼蛋白質基因，37 個tRNA 基因及8 個rRNA。在IRs 區域有18 個基因被重復一次。有45 個編碼蛋白質基因與光合作用相關；除rRNA 基因和tRNA基因外，自我復制相關以及其他基因共計34 個（圖1）。

圖1 無毛青藤葉綠體基因組結構Fig. 1 Structure of the chloroplast genome of I. glabra

2.2 SSR 分析

無毛青藤葉綠體基因組中共獲得61 個SSR 位點（表1），其中，最多的是單核苷酸重復（44 個），其中43 個為A/T 重復，1 個C/G 重復；二核苷酸重復位點3 個，包括1 個AC/GT 重復和2 個AT/AT 重復；三核苷酸位點2 個，均為AAT/ATT；具四核苷酸的SSR 共計11 個，包括7 種類型基序；五核苷酸SSR 僅有1 個，為AAAGT/ACTTT。在所獲得的SSR 中A/T 重復最多，共有43 個，占所有SSR 的70.49%，表明無毛青藤的葉綠體SSR 有使用A 和T 堿基的偏好性。

表1 無毛青藤葉綠體基因組SSR 信息統計Table 1 SSR in the chloroplast genome of I. glabra

2.3 密碼子使用偏好性分析

1.2.5 系統發育分析

用平板凝集試驗對474頭份被檢血清進行檢測，從中可以看出，感染羊布魯式桿菌的羊有七成左右，從中可以看出受到感染的羊群較多，故此，加強對羊群的檢疫是其中的重點和關鍵。

圖2 無毛青藤葉綠體基因組密碼子使用情況Fig. 2 Codon usage in the chloroplast genome of I. glabra

2.4 葉綠體基因組系統進化分析

對包含無毛青藤在內的6 個青藤屬物種葉綠體基因組序列進行多重比對，并構建系統發育樹（圖3）。結果表明青藤屬6 個種分為兩支，其中寬藥青藤和小花青藤為一支，其余4 種為一支。無毛青藤與大花青藤親緣關系較近，無毛青藤與大花青藤首先聚為一支，支持率達到100%（1 000次檢驗水平）；而后又和紅花青藤聚為一個分支，支持率為99%；最后才與銹毛青藤聚為一類。

圖3 6 種青藤屬植物葉綠體基因組的系統進化樹Fig. 3 The phylogenetic tree constructed by using the chloroplast genomes of 6 Illigera species

2.5 SC/IR 邊界分析

對無毛青藤等5 種青藤屬植物葉綠體基因組四分體結構的SC/IR 邊界收縮擴張進行分析，結果如圖4 所示。結果（圖4）表明：6 種青藤屬植物的JLB（LSC/IRb）邊界較為保守，除紅花青藤JLB 邊界位于rpl2基因的編碼區外，其余均位于rpl2和rps19基因編碼區之間；6 種青藤葉綠體基因組的JSB（IRb/SSC）區邊界都位于ndhF基因的編碼區內； JSA（SSC/IRa）區邊界則均位于ycf1基因的編碼區以內；JLA（IRa/LSC）邊界方面，除紅花青藤外，其余均位于trnH基因編碼區之內。

圖4 6 種青藤葉綠體基因組的IR/SC 邊界收縮擴張情況Fig. 4 IR/SC boundary expansion and contraction of the chloroplast genomes of 6 Illigera species

2.6 葉綠體基因組的比較分析

將無毛青藤葉綠體基因組與寬藥青藤、大花青藤、小花青藤、紅花青藤和銹毛青藤葉綠體基因組進行對比分析，其結果如圖5 所示。圖5 結果顯示：6 種青藤葉綠體基因組的基因構成和順序較為保守，與SSC 和LSC 區相比，IR 區更為保守。大多數變異存在于相鄰基因間隔區內，如rps16-psbK、psbM-trnD-GUC、petA-psbJ等。

圖5 6 種青藤葉綠體基因組全長序列對比Fig. 5 Global alignment of the chloroplast genomes of 6 Illigera species

對6 種青藤葉綠體基因組的高變異區進行分析發現，6 種青藤葉綠體基因組的變異主要發生在SSC 和LSC 區，而IR 區大多數序列變異程度并不高，與序列對比分析結果一致；結合mVISTA 圖譜確定rpl32-trnL-UAG（114 948 ～116 065 bp）和petA-psbJ（64 154 ～65 290 bp）為變異度最高的兩個間隔區位置（圖6）。

圖6 6 種青藤匹配區域核酸變異性Fig. 6 Nucleic acid variation information in the matching areas of the chloroplast genomes of 6 Illigera species

3 討論與結論

3.1 討 論

和大多數被子植物一樣，無毛青藤的葉綠體基因組也是四段式結構[29-30]。研究發現，無毛青藤葉綠體全基因組序列全長為153 294 bp，與已公布的大花青藤（156 138 bp）、寬藥青藤（156 123 bp）和紅花青藤（156 658 bp）相比并無太大差異。青藤屬葉綠體基因組序列整體較相似，但也存在較明顯的差異，同時非編碼區的變異遠高于編碼區，在5 個Pi 值較高的區域中，4 個位于基因間區，一個位于基因區（ycf1）。梁鳳萍等[11]則發現菊科植物中所有高變區均位于基因間隔區。而這些高變區的存在，可提供較為豐富的候選DNA 條形碼，可在青藤屬植物的種質鑒定以及系統進化研究等方面提供一定的信息。

采用WRIGHT 等[24]提出的方法，利用CodonW軟件（http://codonw.sourceforge.net）計算同義密碼子相對使用度（RSCU）。

因此，不同種類的潤滑劑對氣缸的工作性能都同時有著正面與反面的影響。要做好氣缸的潤滑優化，必須在選擇潤滑劑時綜合考慮各類潤滑劑。要選用含有不飽和成分較少的型號，同時還要添加如合成油聚α烯烴等成分，以更好地提高氣缸的工作性能。

通過對無毛青藤葉綠體全基因序列的SSR 進行研究，發現SSR 位點中出現頻率最高的為A/T，與杧果Mangifera indica[13]、蒜頭果Malania oleifera[14]、朱蕉Cordyline fruticosa[35]、光葉子花Bougainvillea glabra[36]在相關研究中的結果相一致，且主要位于非編碼區。Niu 等[37]和McCoy 等[38]認為堿基偏好性的產生與能量消耗有關，與A/T 堿基相比，G/C 堿基含有更多的氮原子，因此A/T 富集的堿基在突變時能量耗損會更少。而堿基的使用偏性在影響SSR 位點類型和密碼子選擇的同時，還對葉綠體基因組各個分區的穩定性產生了影響[39]。目前對青藤屬葉綠體全基因序列SSR 的研究還較少，檢索無毛青藤葉綠體基因組SSR 位點，繼而結合分子生物學實驗進行遺傳變異分析、分子標記開發等研究，可為進一步開發青藤屬其他植物的SSR 位點提供理論參考。

雖然葉綠體基因組的進化速率較慢，但也能提供用于鑒定物種的變異位點，如matK和trnLtrnF等片段[40]。隨著現代測序技術的不斷進步，葉綠體基因組的獲取變得更為方便，可利用該基因組對青藤屬不同物種的鑒定提供參考。目前，蓮葉桐科植物系統發育關系還有許多不確定之處，蓮葉桐科共5 個屬，分別為青藤屬、蓮葉桐屬、旋翼果屬Gyrocarpus、楊樟屬和九節桂屬Sparattanthelium，在Michalak 等[16]的研究中，蓮葉桐科分為兩支，其中一支由蓮葉桐屬、楊樟屬和青藤屬組成，但該研究對青藤屬內植物的物種親緣關系并未進行很好的澄清。目前僅有3 個青藤屬植物的葉綠體基因組被公布。因此，想要更清楚地闡明該屬植物系統的發育關系，需要有更多相關的葉綠體基因組數據進一步佐證。

系統發育分析結果顯示，無毛青藤與大花青藤的親緣關系最近，其次為紅花青藤和銹毛青藤，與寬藥青藤和小花青藤關系最遠，這與Michalak等[16]的相關研究結果相一致，他們也認為寬藥青藤與無毛青藤關系相距較遠；但他們卻指出，寬藥青藤和紅花青藤關系最近，這與本研究結果不一致。在他們的研究中，并未使用小花青藤等分布于中國的物種，而本研究中僅用了5 個分布于中國的種。造成分歧的原因可能是使用的樣本較少且采樣地存在較大差異造成的。

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?［日］一瀬智司:《公企業會計と公経営會計——公會計の公明化》，《會計検査研究》1號(創刊號)1989年第8期。

3.2 結 論

無毛青藤的葉綠體基因組序列全長為153 294 bp，GC 含量為39.1%。其結構包括大單拷貝區（LSC，85 225 bp）、小單拷貝區（SSC，18 779 bp）以及反向重復序列（IRs，26 254 bp）。共注釋得到131 個基因，其中，84 個位于LSC 區，SSC 區13 個，兩個IR 區各17 個。密碼子偏好使用A 或U 結尾，SSR 組成以A 和T 堿基為主。區別于其他物種，其基因組相對較大，并與大花青藤具有較近的親緣關系。研究結果可為無毛青藤及其近緣種的葉綠體基因組系統進化分析、物種鑒定和基因工程等相關研究提供重要的理論參考。