超分辨率成像研究尿石素不同亞型對線粒體形態亞群差異分布的影響

孟 鵬，吳忠玉

（1. 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥物研究所，山東 濟南 250117；2. 濟南良福精合醫藥科技有限公司，山東 濟南 250117）

尿石素（urolithin）是天然多酚類化合物，是食物中的鞣花單寧被腸道菌群代謝產生的一種次生代謝產物[1]。研究表明，尿石素具有抗氧化、抗炎、抗癌、誘導線粒體自噬等多種生物活性[2-5]。尿石素A（urolithin-A，UA）、尿石素B（urolithin-B，UB）、尿石素C（urolithin-C，UC）是目前研究最廣泛的尿石素的異構體。

傳統的食品和藥品毒性測定方法，如cell counting kit-8（CCK-8）、噻唑藍法（MTT）、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）等，可在多細胞水平上評估藥物的毒性，卻無法在亞細胞水平上實現藥物毒性的準確評估和分析[6-9]。CCK-8試劑中的主要成分是2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（WST-8），它被細胞線粒體中的脫氫酶氧化為具有高度水溶性的黃色甲臜產物。CCK-8的細胞毒性檢測中生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，因此CCK-8可在多細胞水平進行毒性檢測。以熒光顯微成像技術為原理的結構光照明顯微鏡（structure illumination microscopy，SIM），利用結構光突破衍射極限，然后通過結構光的旋轉移動和算法識別，實現了線粒體的超分辨成像[10]。此外，SIM還具有光毒性低、成像速度快、熒光探針要求低和樣品制備簡單等優點[11-12]。細胞遇到有毒物質時，線粒體中球狀線粒體的比例增加，可以此作為判斷藥物毒性大小的依據[13]。因此可利用SIM對線粒體結構的超分辨成像，評估尿石素亞細胞水平的毒性差異（見圖1）。

圖1 CCK-8和SIM毒性檢測原理對比

本文通過SIM于亞細胞水平研究3種尿石素亞型UA、UB和UC對HeLa細胞中線粒體的影響，并采用線粒體長寬比的數據分析方法探究3種亞型在亞細胞水平的毒性，建立藥物毒性亞細胞水平毒性研究方法；并將SIM毒性檢測方法與經典的細胞毒性檢測方法CCK-8對比，評價UA、UB和UC在多細胞層面和亞細胞層面的細胞毒性差異。

1 材料與儀器

1.1 儀器

數顯三用恒溫水箱（山東歐萊博）；TDZ5-WS醫用離心機（湖南湘儀）；QP-160二氧化碳培養箱（濟南鑫貝西）；BSC-1500IIA2-X生物安全柜（濟南鑫貝西）；XD-202倒置生物顯微鏡（南京江南永新光學）；F-320熒光分光光度計（天津港東科技）；LDZF-50L-II立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安）；UV-2600紫外可見分光光度計（日本島津）；SIM顯微鏡（Delta Vision，USA）。

1.2 藥品與試劑

尿石素A（1143-70-0），尿石素B（1139-83-9），尿石素C（165393-06-6）（麥克林）；胎牛血清和MTG（Mito-Tracker Green）（賽默飛）；CCK-8（Med Chem Express）；PBS和DMEM（Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium）（上海達特希爾和）；Penicillin-streptomycin（10000 U/ml，Gibco）。

2 方法

2.1 細胞培養

HeLa細胞取自劉飛實驗室（山東省藥學科學院）。HeLa細胞于DMEM培養基（添加10 % FBS、1 %青霉素和鏈霉素）中培養，并置入37 ℃，5 %二氧化碳培養箱。

2.2 細胞毒性檢測

用培養基稀釋的HeLa細胞以8×103個/孔的密度接種至96孔板，并于37 ℃含5 % CO2的培養箱中培養24 h。然后使用含0，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μmol/L尿石素的DMEM溶液代替96孔板中的原始培養基。培養12 h后，向每個孔中加入10 μl CCK-8溶液，并在培養箱中孵育2 h。最后，通過酶聯免疫吸附試驗測定450 nm處的吸光度。

2.3 藥物孵育

將UA、UB、UC用無色DMEM分別配制為最終濃度為10 μmol/L和40 μmol/L溶液，置于37 ℃水浴預熱10 min。然后分別將細胞與各個濃度細胞亞型的溶液孵育12 h，用預熱的DMEM洗滌7次，然后進行活細胞標記。

2.4 活細胞標記

線粒體的標記采用線粒體商業探針MTG。具體操作：將MTG用無色DMEM配制為最終濃度為100 nmol/L溶液，置于37 ℃的水浴鍋中預熱10 min。然后，將細胞與100 nmol/L MTG孵育30 min后，用預熱的DMEM洗滌7次，最后更換預熱的無色DMEM用于超分辨顯微鏡成像。

2.5 SIM顯微鏡成像

HeLa細胞以1×105個/ml的密度接種于35 mm玻璃底培養皿，并與2 ml 含10 % FBS的DMEM一起孵育24 h（5 % CO2，37 ℃）。經過藥物孵育12 h和活細胞標記后在配備100×/1.42數值孔徑油浸物鏡和固態激光器下成像。MTG在488 nm處激發并于500～550 nm處發射。

2.6 數據分析

使用GraphPad Prism 8和Image J進行統計分析。對數據進行正態性檢驗；在正態分布情況下，結果統計比較用t檢驗；在非正態分布情況下，結果統計比較用Mean-Whitney檢驗。顯著性水平設置為P＜0.05具有統計學差異，數據表示為平均值±平均值的標準誤差（±s）。線粒體的長寬比分析中，按照線粒體長寬比的大小將棒狀和顆粒狀的線粒體分成1≤長/寬＜1.5（圓狀線粒體），1.5≤長/寬＜2（中間狀線粒體），2≤長/寬＜5（管狀線粒體），5≤長/寬（纖維狀線粒體）4類進行分析（見圖2）。

圖2 線粒體長寬比分析

3 結果

3.1 CCK-8對尿石素3種亞型的細胞毒性分析

使用CCK-8分別檢測UA、UB、UC（1～40.0 μmol/L）孵育HeLa細胞12 h后的細胞毒性（見圖3）。藥物濃度為10.0 μmol/L時，和對照組相比3組均無明顯的細胞毒性。表明3種藥物的毒性微弱，CCK-8無法檢測出尿石素3種亞型10.0 μmol/L濃度以下的毒性。藥物濃度為20 μmol/L時，與對照組相比，只有UC能檢測到明顯的藥物毒性，表明UC毒性最強。藥物濃度為40.0 μmol/L時，與對照組相比，3種藥物均表現顯著的細胞毒性。

圖3 3種尿石素亞型的細胞毒性檢測

3.2 SIM顯微鏡對尿石素3種亞型的分析

3.2.1 線粒體的SIM成像 為了避免藥物自發熒光對SIM成像的影響，使用熒光分光光度計分析3種藥物10.0 μmol/L時的熒光強度，結果表明，488 nm波長激發下無顯著的熒光（見圖4），因此選用商業線粒體探針MTG，用于活細胞線粒體成像（MTG在488 nm下發綠色熒光）。

圖4 3種尿石素亞型激發光下的熒光光譜（488 nm）

將未經藥物處理的HeLa細胞用MTG進行活細胞標記后，用SIM進行成像（見圖5）。由圖5可見，在超高分辨率SIM顯微鏡下，可清晰地觀測到未進行藥物處理的細胞中的絲狀的棒狀線粒體，并能看到線粒體的單個形態和線粒體嵴的構造。使用圖像處理軟件Image J分析未經藥物處理的HeLa細胞線粒體的長/寬數據，正常的HeLa細胞中管狀的線粒體占比最大，纖維狀的線粒體占比最小。

圖6 濃度10.0 μmol/L和40.0 μmol/L的3種尿石素亞型的線粒體SIM成像和長寬比分析

3.2.2 藥物處理的細胞線粒體的形態分析 根據3.1項結果，藥物濃度10.0 μmol/L是3種亞型均檢測不到細胞毒的最大濃度，40.0 μmol/L是3種亞型均能檢測到顯著細胞毒的最小濃度。因此將10.0 μmol/L和40.0 μmol/L作為SIM成像的濃度，與SIM毒性檢測對比。分別使用濃度為10.0 μmol/L和40.0 μmol/L的UA、UB、UC孵育HeLa細胞12 h，MTG標記活細胞之后，使用SIM成像并統計分析線粒體長寬比（見圖5）。

由圖5可見，藥物濃度為10.0 μmol/L時，3個加藥組均球狀線粒體增加和管狀的線粒體減少，與對照組相比呈顯著性，表明線粒體形態損傷，檢測到3種尿石素亞型的毒性。藥物濃度為40.0 μmol/L時，3個加藥組也球狀線粒體增加和管狀的線粒體減少，與對照組相比呈顯著性；UC組的球狀線粒體比例最大，管狀線粒體比例最小，這表明相同濃度的3種藥物亞型中UC在亞細胞水平毒性最強，與CCK-8的結果一致。結果表明，SIM在亞細胞水平的細胞毒性檢測方法能在更低的藥物濃度檢測到藥物毒性，這對尿石素在食品藥品領域的應用和作用機制研究具有指導意義。

4 結論

通過CCK-8多細胞水平和SIM亞細胞水平的細胞毒性檢測方法，評估了尿石素3種亞型的細胞毒性。3種尿石素亞型對HeLa細胞均有輕微的細胞毒性影響，且UC的細胞毒性在3種亞型中最強，為后續的尿石素的相關研究提供了參考。CCK-8和SIM超分辨成像方法對比表明，SIM亞細胞水平的細胞毒性檢測能在更低的藥物濃度時檢測到毒性。SIM為食品和藥品亞細胞水平的毒性評估提供了新方法。

本文基于超分辨成像技術，開發了新的藥物評估方法，用于精準分析藥物亞型的活性差異和潛在細胞毒性。與傳統細胞毒性測定方法相比，超分辨成像方法可在亞細胞水平上實現藥物精準評估。該方法可用于食品與藥品亞細胞水平的毒性檢測。