木薯糖轉運蛋白MeSWEET18的克隆與功能分析

薛晶晶　安飛飛　朱文麗　羅秀芹

關鍵詞：木薯；糖轉運蛋白；功能分析；糖轉運能力；非生物脅迫

中圖分類號：S533 文獻標識碼：A

蔗糖是大多數植物光合作用的主要碳水化合物，從葉片向各庫器官長距離運輸，促使根、花、果實和種子生長發育[1]。葉綠體通過光合作用合成蔗糖，蔗糖通過胞間連絲進入韌皮部薄壁細胞組織，由SWEET（sugar will eventually be exportedtransporter） 蛋白卸載至質外體， 再通過SUT（sucrose transporter）蛋白轉運至伴胞細胞和篩管分子，然后由定位于篩分子細胞-伴胞復合體上的H⁺共轉運蛋白通過質子動力勢將同化物送進韌皮部進入長距離運輸。

SWEET 蛋白屬于MtN3/saliva 基因家族，也稱為MtN3/saliva/SWEET，可以轉運己糖和蔗糖，并介導糖外流到質外體，是糖轉運蛋白中的一員，含有2 個MtN3/saliva 跨膜螺旋結構域。已測序的植物基因組中均有發現SWEET 家族成員。綠色熒光蛋白融合研究發現，大部分植物SWEETs 家族基因位于細胞質膜上[2-3]。根據SWEETs 蛋白轉運糖的類型不同，所有SWEETs 蛋白都可以分成4 個分支，第一分支和第二分支SWEET 蛋白主要選擇轉運己糖，尤其是葡萄糖；第三分支SWEET蛋白優先跨膜轉運蔗糖；第四分支的SWEET 蛋白主要介導果糖的轉運[4]。同SUT 一樣，SWEET可以自身互作形成同聚物，也能相互之間形成異聚體，進而形成更大的通道提高轉運效率[5]。SWEETs 家族基因在植物運輸糖類、生殖和發育、植物逆境、與病原體互作等方面發揮著重要作用[6]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是熱帶亞熱帶地區重要的糧食作物[7]。木薯SWEET 家族共有28 個同源基因，COHN 等[8]發現地毯黃單胞菌的毒力可以通過轉錄激活因子TAL20Xam668 特異性誘導木薯MeSWEET10a 的表達，并最終導致木薯細菌性枯萎病的蔓延。胡梅珍[9]、薛蓓蓓等[10]對木薯SWEET 家族基因進行生物信息學分析，明確其對己糖的轉運能力以及不同木薯種質的表達情況。劉秦等[11]克隆了木薯MeSWEET1 基因，并將其定位于細胞膜上，組織特異性分析發現，成熟葉片中相對表達量最高。朱柏光等[12]分析木薯MeSWEET3b 的糖轉運能力，發現其轉運半乳糖，且受木薯黃單胞菌（Xam）的誘導。未發現木薯其他SWEET 蛋白的功能研究。木薯MeSWEET18 在不同組織器官中均具有較高的表達水平[13]，可能在木薯的生長發育及逆境脅迫中起著重要作用。因此，本研究以木薯MeSWEET18（Manes. 15G011300）為研究對象，通過克隆、體外驗證以及非生物脅迫等方法，研究該基因在木薯中的功能，為木薯SWEET 基因家族相關成員的功能研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采用生長于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質資源圃華南9 號（SC9）品種作為研究材料。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取與cDNA合成 總RNA提取參照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen）的操作說明進行，用Dnase I 柱上消化RNA 樣品中殘留的微量DNA。用1 μgRNA 逆轉錄合成第一鏈cDNA。cDNA 第一鏈合成參照RevertAid RT 逆轉錄試劑盒（Thermo）的操作說明進行。

1.2.2 MeSWEET18 基因全長cDNA 擴增 以Phytozome12.0 中Manihot esculenta v7.1（cassava）數據庫的MeSWEET18 序列設計引物（5'-TTGAAGAAGTTGTTCATTTC-3'和5'-TCAACTCCCTGGCCCTTACT-3'），采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行cDNA 序列的克隆。全長cDNA 的擴增體系含PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL、MeSWEET18-F（10 μmol/L）2.5 μL、MeSWEET18-R（10 μmol/L）2.5 μL、cDNA 模板0.5 μL、無菌水補足至50 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共34 個循環；72 ℃延伸10 min。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產物，回收純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 載體（TransGen）上測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用NCBI 網站ORFFinder 軟件對獲得的SC9 cDNA 序列進行開放閱讀框（ORF）預測，同時翻譯成蛋白序列。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）軟件分析該蛋白的分子量與等電點；采用NCBI 在線軟件CDD 分析蛋白的保守結構域； 采用TMHMM Server v.2.0 （ http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）在線軟件進行跨膜結構域分析；運用PSORT 在線軟件對該蛋白進行亞細胞定位預測；運用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件預測該氨基酸序列的疏水性/親水性；利用SOPMA SECONDARYSTRUCTUREPREDICTIONMETHOD（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl）在線軟件預測蛋白的二級結構。從NCBI 和Phytozome12.0 數據庫下載木薯和擬南芥SWEET 蛋白家族基因，利用MEGA6 軟件，選擇neighbour-joining（NJ）模型，并進行1000 次bootstrap 統計學檢驗，構建包括MeSWEET18 蛋白序列在內的木薯和擬南芥SWEET蛋白的系統進化樹。

1.2.4 不同生育期的實時熒光定量PCR 分析分別取SC9 形成期（植后4 個月）、膨大期（植后7 個月）及成熟期（植后10 個月）葉片、葉柄、莖桿和塊根作為研究材料。每個材料每個生育期隨機選取3 株，混合保存于–80 ℃冰箱中，3 次重復。利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen）提取RNA。然后取1 μg RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA，稀釋10 倍后作為實時熒光定量PCR 分析的模板。

采用Thermo 公司的CFX 實時熒光定量PCR系統，實驗操作按儀器使用說明書進行。10 μL反應體系中，包含1 μL 模板、5 μL 2×SYBRPremix、10 μmol/L qPCR-MeSWEET18-F 和qPCRMeSWEET18-R 引物（5'-GGAGTTTGAGAGTCTTCCTTATGTG-3'和5'-GAGTTACATAGACGATTTCCACCAG-3'）各0.4 μL、無菌水補足至10 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，共40 個循環，循環完成后進行產物溶解曲線分析。以MeActin 作為內參基因（5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'和5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'），以2-△△CT 算法進行基因的相對定量表達。采用Dunnetts 法對同一部位不同發育期的相對表達結果進行統計分析。

1.2.5 MeSWEET18 的糖轉運特性分析EBY.VW4000 酵母是一種己糖轉運功能缺陷型酵母突變體，此菌株無法在己糖為唯一碳源的尿嘧啶（ura）缺陷型選擇培養基SD-ura 平板上生長，可以在麥芽糖為唯一碳源的選擇培養基SD-ura平板上恢復生長[14]。運用包含pDR196 表達載體序列的引物（ 5-ATATACCCCAGCCTCGATGGAAATCTTGAGTTTG-3 和5-CGATAAGCTTGATATCTTATTCCGATGA-TGGAGAT-3 ） 擴增MeSWEET18 的CDS 序列，采用DNA 無縫克隆技術將MeSWEET18 的CDS 序列與酵母表達載體pDR196 進行重組，獲得MeSWEET18-pDR196 表達載體，使用聚乙二醇/醋酸鋰高效酵母轉化法將重組后的MeSWEET18-pDR196 質粒轉化到EBY.VW4000 酵母菌中。利用含有2%麥芽糖的SD-ura 培養基過夜培養至OD600 約1.0，然后連續稀釋至OD600 分別約0.1、0.01、0.001，分別涂布于含有2%麥芽糖、2%葡萄糖、2%果糖等不同糖源的缺陷型選擇培養基SD-ura 平板上，30 ℃，倒置培養3～5 d，觀察生長情況。

1.2.6 MeSWEET18 在不同糖處理下的表達分析將生長20 d 左右的SC9 水培苗，于黑暗條件下進行不同糖源的暗處理。以未進行處理的SC9 水培苗作為對照，分別添加水、2%蔗糖、2%葡萄糖、2%果糖的溶液中分別培養2 d 和5 d，每個時間點不同處理隨機選取3 株，混合保存于–80 ℃冰箱中，3 次重復，進行實時熒光定量PCR 分析。

1.2.7 MeSWEET18 在SC9 非生物脅迫下的表達分析 將SC9 莖桿水培20 d 后，分別進行鹽脅迫（8 g/L NaCl）、干旱脅迫（100 mmol/L 甘露醇）、氧化脅迫（10% H2O2）處理，各處理時間分別為0（CK）、12、24、36 h。低溫處理采用15 ℃ 24h，后降至4 ℃ 24 h。分別取葉片、葉柄、莖桿和根4 個部位的樣品，保存于–80 ℃冰箱中，3次重復，進行實時熒光定量PCR 分析。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prifm 5.0 軟件進行數據分析、作圖以及Dunnetts 檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 MeSWEET18 基因全長CDS克隆及蛋白質結構特性分析

通過RT-PCR 擴增及測序，獲得MeSWEET18基因編碼框序列714 bp，編碼237 個氨基酸（圖1），蛋白分子質量為25.94 kDa，理論等電點為6.57，不穩定系數為37.50，屬于穩定類蛋白。通過NCBI 在線軟件CDD 分析發現，該蛋白含有2個保守結構域，在N 端含有植物SWEET 家族基因共有的保守結構域MtN3_slv，C 端含有PQ-loopsuper family 保守結構域。TMHMM Server v.2.0在線軟件預測顯示，該蛋白含有7 個跨膜結構域，是典型的膜蛋白；PSORT 分析顯示，MeSWEET18定位于液泡的可能性為85.71%；ProtScale 預測表明，MeSWEET18 蛋白屬于親水性蛋白；SOPMA分析顯示，MeSWEET18 蛋白二級結構由44.30%α-螺旋、20.68%延伸鏈、3.38% β-轉角和31.65%無規則卷曲組成。

2.2 MeSWEET18 的系統進化樹分析

已發表的擬南芥和葡萄樹SWEET 蛋白進化樹分析結果顯示，SWEET 蛋白可以劃分為4 個亞類[4， 15]。對木薯和擬南芥的SWEET 蛋白進行系統進化樹分析，發現木薯MeSWEET18 與擬南芥的AtSWEET16 和AtSWEET17 位于同一進化枝上，屬于CladeⅣ，該亞類共含有6 個木薯SWEET基因（圖2）。采用DNAMAN軟件對MeSWEET18、AtSWEET16 和AtSWEET17 氨基酸序列進行比對，結果顯示：MeSWEET18 和AtSWEET16 的同源性達到53.23%，MeSWEET18 和AtSWEET17的同源性達到56.05%，含有2 個明顯的PQ-loopsuperfamily 保守結構域。

2.3 不同生育期MeSWEET18 的表達分析

分析MeSWEET18 在SC9 形成期、膨大期及成熟期葉片、葉柄、莖桿和塊根的表達情況。結果顯示：MeSWEET18 在葉片中的表達隨著木薯的生長表現為先上升后下降；在葉柄中的表達隨著木薯的生長持續上升，在成熟期達到最大；形成期和膨大期的莖桿表達無差異，成熟期呈上升趨勢；MeSWEET18 在塊根膨大期表達量最高，隨著木薯生長，表達量低于木薯形成期（圖3）。

2.4 MeSWEET18 的糖轉運特性分析

為了驗證MeSWEET18 的糖轉運特性，將其轉化至己糖轉運缺陷型酵母EBY.VW4000 中，該酵母無法在己糖為唯一碳源的尿嘧啶缺陷型SD-ura 選擇培養基上生長，但是可以在麥芽糖為唯一碳源的培養基上恢復生長（圖4）。結果表明，MeSWEET18 可以轉運果糖，但不能轉運葡萄糖，脫氧-2-葡萄糖的添加對MeSWEET18 無影響。

2.5 MeSWEET18 在不同糖處理下的表達分析

以未進行黑暗處理的SC9 水培苗作為對照，黑暗下分別添加水、2%蔗糖、2%葡萄糖和2%果糖的溶液進行處理2 d 和5 d。黑暗條件下，MeSWEET18 在不同糖處理下的表達水平顯示，黑暗處理2 d 時，水、2%蔗糖、2%葡萄糖和2%果糖處理對MeSWEET18 的表達均有影響；隨著黑暗處理時間延長到5 d，MeSWEET18 的表達在不同糖處理下表達呈極顯著下降趨勢（圖5）。

2.6 MeSWEET18 在非生物脅迫下的表達分析

將SC9 進行水培培養20 d 后，進行鹽、干旱、氧化以及低溫脅迫，各脅迫處理時間為0、12、24、36 h。采集每個時間點的葉片、葉柄、莖桿和根進行表達分析（圖6）。結果發現，葉片在鹽脅迫12 h 時表達水平提高了2.07 倍，隨著時間延長至24 h，表達水平較0 h 急速下降至0.05 倍；與0 h 相比，莖桿和根的表達水平在24 h 出現下調，隨著處理時間延長至36 h，表達水平呈極顯著上調，分別是0 h 的3.69 倍和5.34 倍。干旱脅迫下，與0 h 相比，葉片和葉柄在處理36 h 時表達水平分別提高了9.89 倍和20.82 倍。氧化脅迫下，MeSWEET18 在SC9 的葉片、葉柄和莖桿的表達均呈顯著下調，但是根的表達水平出現顯著上調，24 h 的表達水平是0 h 的18.01 倍。低溫（15 ℃）處理24 h，MeSWEET18 在葉片、葉柄、莖桿和根的表達呈顯著下降，隨著低溫（4 ℃）處理24 h，MeSWEET18 在莖桿和根中的表達較0 h 呈現上升趨勢。

3 討論

SWEET 轉運蛋白在植物中廣泛存在，參與多種生理過程，如韌皮部裝載、籽粒灌漿、花粉發育、葉片衰老以及響應生物和非生物脅迫等[16-17]。本研究從木薯SC9 中克隆獲得MeSWEET18 基因序列，完整開放閱讀框為714 bp，編碼237 個氨基酸。系統進化樹分析表明，MeSWEET18 位于CladeⅣ，與擬南芥AtSWEET16 和AtSWEET17屬于同一進化分支。AtSWEET17 在葉片的果糖分配上發揮著重要作用，ATSWEET17 沉默株系表現為果糖積累功能紊亂、植株發育不良以及影響種子產量等[18]。對MeSWEET18 的糖轉運能力進行檢測，發現其主要轉運果糖，與AtSWEET17主要影響果糖積累的研究結果一致。

擬南芥中過表達AtSWEET16 會促進植株發芽、生長發育以及提高植株對凍害的耐受性[19]。石竹DsSWEET17 的表達受外源果糖、葡萄糖、鹽脅迫和滲透脅迫的影響，轉化擬南芥后，能夠促進根的生長[20]。萱草HfSWEET17 在低溫脅迫下表達上調，過表達煙草能夠提高其抗寒性[21]。茶樹CsSWEET17 的交替剪接受低溫脅迫的誘導，過表達植株顯著降低了低溫脅迫下電解質滲出水平[22]。麻風樹JcSWEET16 基因能夠響應葉片的干旱和鹽脅迫，在擬南芥中過表達能夠改良其開花時間和耐鹽水平，但不影響其耐旱性[23]。對木薯SC9 水培苗進行鹽、干旱、氧化和低溫等非生物脅迫，結果發現MeSWEET18 在葉片、葉柄、莖桿和根等不同部位的表達變化差異顯著，表明MeSWEET18 能夠響應多種非生物脅迫。

外源施加20 mmol/L 蔗糖處理杭白菊，導致CmSWEET17 基因特異表達；過表達CmSWEET17可促進雙節莖處理的腋芽生長。因此，CmSWEET17 基因可能通過生長素轉運途徑參與了蔗糖誘導的腋芽生長過程[3]。對木薯SC9 的水培苗進行蔗糖、果糖和葡萄糖的黑暗處理，發現隨著黑暗處理時間的增加，MeSWEET18 的表達呈現顯著下調，說明MeSWEET18 不僅對果糖脅迫敏感，對其他糖的脅迫也能產生響應。楊官顯等[24]對蘋果MdSWEET17 的研究發現，其在根和葉片中大量表達。在果實發育期，MdSWEET17的表達水平與果糖含量呈顯著負相關[18， 24]。研究MeSWEET18 在木薯SC9 形成期、膨大期和成熟期的葉片、葉柄、莖桿和塊根的表達，結果發現，其在成熟期的葉片、葉柄和莖桿大量表達，而在塊根中的表達隨著木薯的生長呈現先上升后下降的趨勢。

在后續研究中，將測定SC9 不同非生物脅迫下蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖的變化，分析MeSWEET18 啟動子序列中與非生物脅迫、糖信號等相關的順式作用元件。構建過表達載體通過農桿菌介導法遺傳轉化木薯，對獲得的過表達株系進行不同的非生物脅迫，分析MeSWEET18 以及糖代謝相關基因的表達趨勢，為研究木薯糖代謝的分子通路提供依據。