整合素αvβ6 在頭頸部鱗狀細胞癌中的作用研究

趙瑞 華清泉

整合素是細胞外基質配體的異二聚體跨膜受體[1]，由α 和β 亞基結合而成[1]，其與配體結合后不僅具有粘附功能，還能啟動跨細胞膜的雙向信號傳遞[2]，介導細胞-細胞和細胞-細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的相互作用[3]。其中最為特殊的是上皮限制性整合素αvβ6[4]，其僅在上皮細胞上表達，在健康成人組織中缺失或低表達，而在需要組織重構的發育、傷口愈合、癌癥和纖維化等過程中表達上調[5，6]。

1 整合素αvβ6 的結構和功能

整合素αvβ6 是由αv 和β6 亞單位組成的，分為胞外、跨膜和胞質結構域[7]。編碼αv 亞基的基因（CD51）定位于2q31-q32 染色體,編碼β6 亞基的基因(ITGB6)則在2q24-q31 染色體上[8，9]。αv 亞基主要負責配體的識別，而β6 亞基主要負責信號轉導[9]。β6 亞基只能與αv 亞基結合，是整合素αvβ6 的限速亞基,其控制著整合素αvβ6 的表達和有效性[5]。整合素αvβ6 的獨特性可能正是因為β6 亞基的結構特異性[9]。

整合素αvβ6 能特異性識別結合包括纖維連接蛋白、骨橋蛋白、玻璃體連接蛋白、肌鍵蛋白-c 和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGFβ）前肽在內的含有RGD 基序（精氨酸-甘氨酸-酪氨酸）的蛋白[1，5]。整合素通過將信號分子和連接蛋白募集到β 亞基的胞漿尾[10]，從而參與調節增殖、遷移、存活、分化、腫瘤侵襲和轉移等多種過程。在多達三分之一的實體腫瘤中發現整合素αvβ6 的表達升高，并與患者較差的預后和腫瘤侵襲性增加相關。因此，整合素αvβ6 是檢測和治療這類癌癥的一種極好的細胞表面差異表達分子[5，11]。

2 整合素αvβ6 促進HNSCC 的侵襲與轉移

多項研究發現整合素αvβ6 在HNSCC 中過表達，有研究稱整合素αvβ6 表達在95%的HNSCC 腫瘤細胞上[12]。有實驗證實在41%的口腔黏膜白斑標本中也檢測出整合素αvβ6 高表達，并證實整合素αvβ6 在口腔鱗癌及口腔黏膜白斑中高表達與疾病的惡性進展相關[13]。整合素αvβ6 通過介導多種經典致癌途徑促進HNSCC 腫瘤細胞的侵襲和轉移（見圖1、圖2）。

圖1 TCGA 數據庫顯示ITGB6 在HNSCC 癌組織中表達明顯高于癌旁組織且差異有統計學意義（t=-7.7384，P＜0.05）

圖2 整合素αvβ6 通過介導多種致癌途徑促進HNSCC腫瘤細胞的侵襲和轉移

2.1 整合素αvβ6 促進HNSCC 癌細胞的上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）

EMT 是細胞由上皮狀態向間質狀態轉變，并使其獲得遷移和侵襲性行為的生物學過程[14，15]。EMT在胚胎發育和傷口愈合等重要生理過程中發揮著重要作用，其特點是細胞粘附性的喪失和運動性的增加。EMT 最主要的標志是上皮標志物E-鈣黏蛋白表達下調[16]。鈣依賴的細胞表面蛋白E-鈣黏蛋白是促進上皮細胞之間粘附的主要蛋白，細胞表面E-鈣黏蛋白通過β-連接素將細胞連接到細胞骨架以維持細胞間連接和上皮功能。HNSCC 腫瘤細胞侵襲時E-鈣黏蛋白被內吞而β-連接素被釋放易位到細胞核，誘導EMT 基因的轉錄。在HNSCC 腫瘤細胞中，E-鈣黏蛋白缺失導致細胞間粘附被破壞，從而使腫瘤細胞侵襲轉移能力增加[14-16]。

研究證明在HNSCC 中，EMT 促進HNSCC 侵襲，并且EMT 過程導致的基底膜破壞以及基因和表型改變的細胞侵襲底層間質是上皮發育不良（癌前）向HNSCC 發展的重要原因[17]。此外，實驗證實EMT與HNSCC 患者預后相關。還有研究證實在HNSCC中存在E-鈣黏蛋白到N-鈣黏蛋白的轉換，高表達的N-鈣黏蛋白與腫瘤的惡性程度密切相關。因此，EMT 促進HNSCC 進展可能是通過鈣黏蛋白轉換發生的。在喉鱗狀細胞癌組織中檢測到E-鈣黏蛋白呈低表達，這提示EMT 激活并在喉癌發生發展過程中發揮重要作用[16]。

EMT 過程可能是由Notch 信號通路及MAPK磷酸化來調控。在口腔癌中，我們認為Notch 可以作為腫瘤啟動子。此前研究證實，當β6 亞基被阻斷時，Notch 通路被抑制了75%，而MAPK 的激活也顯著降低。這表明整合素αvβ6 與配體結合是產生EMT 周圍初始信號事件的必要條件[4]。

2.2 整合素αvβ6 激活HNSCC 癌細胞內的TGF-β1

整合素αvβ6 是TGF-β1 的激活劑[9]，當整合素αvβ6 與LAP1 中包含的RGD 基序結合時，會引發構象改變導致TGF-β1 激活。整合素αvβ6 通過激活TGF-β1 以及該細胞因子對細胞的抗增殖作用，在正常上皮細胞中作為腫瘤抑制因子。敲除ITGB6基因的動物易于自發發生良性和惡性腫瘤的研究結果證明了這一點。在癌癥發展過程中，整合素αvβ6-TGF-β1 相互作用的復雜平衡被打破，TGF-β 信號通路嚴重失調，導致TGF-β1 通過經典的Smad 信號通路以及非Smad 信號通路從腫瘤抑制因子轉變為腫瘤促進因子。此外，TGF-β1 在癌細胞中上調尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA) 的表達，而uPA 通過纖溶酶原的激活，可能激活潛伏的TGF-β1，從而提供一個正反饋回路來放大TGF-β1 在癌細胞中的活性[18，19]。

TGF-β1 激活后通過多種機制增加HNSCC 細胞的遷移侵襲以及轉移能力，包括通過TGFβ1／ALK／Smad 信號通路誘導HNSCC 血管生成、調節腫瘤微環境、促進EMT、免疫抑制作用[20]。體內及體外實驗均發現過表達的ITGB6 可以通過上調和活化TGFβ1,促進口腔鱗癌細胞侵襲轉移[21]。同時用外源性TGF-β1 刺激口腔癌細胞株后發現細胞株的遷移和侵襲能力明顯增強[22]。在HNSCC 發生過程中，TGFβ1 激活后還可導致參與核小體重塑等過程的轉移相關蛋白1（metastasis associated protein 1, MTA1）表達上調，從而使HNSCC 腫瘤細胞增殖及侵襲能力增加，促進腫瘤轉移。侵襲實驗也證實TGF-β1 能夠促進舌癌細胞的侵襲能力增強[23]。整合素αvβ6 依賴的TGF-β1 激活也可誘導附近基質細胞分化成肌成纖維細胞。肌成纖維細胞是高度收縮的細胞，可以結合其他αv 整合素，如αvβ1，進一步激活腫瘤細胞周圍的TGF-β 前體。同時，肌成纖維細胞又可促進HNSCC 侵襲。既往實驗證實肌成纖維細胞在體內外促進口腔鱗癌細胞的侵襲，并有研究稱腫瘤間質中肌成纖維細胞的存在與舌癌的局部復發和轉移有關。TGF-β1 是驅動肌成纖維細胞轉分化最有效的細胞因子[24-28]。

2.3 整合素αvβ6 促進HNSCC 癌細胞的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）分泌MMPs是一類鋅結合內肽酶[29]，負責重塑細胞外基質結構。在癌癥進展中它們的主要作用是消化細胞外基質和血管基底膜的成分，促進腫瘤生長、細胞遷移、腫瘤侵襲。在所有MMPs 中，IV 型膠原酶（MMP-2 和MMP-9）在癌癥進展中起關鍵作用，因其可降解基底膜的主要成分IV 型膠原。與正常細胞相比，MMP-2 及MMP-9 在HNSCC 中均有高表達。MMP-9 mRNA 的過表達與口腔癌前病變發展為鱗癌相關。此外，據報道MMP-9 的高表達與HNSCC 患者的生存率有關，與腫瘤侵襲程度、淋巴轉移、靜脈腫瘤血栓形成及病理分期有關[30-34]。

整合素αvβ6 過表達可誘導MMP-9 的分泌增加，并且其分泌量與β6 的表達量呈正相關。實驗證實MMP-9 過表達導致的IV 型膠原蛋白降解在舌癌侵襲轉移中起重要作用[35]。應用蛋白酶抑制劑抑制MMP-9 的功能發現細胞的生長和遷徙也受到抑制[36]。另有學者發現在侵襲性差的口腔鱗癌細胞株中誘導表達β6 亞基，可通過誘導MMPs 增加，促進細胞對基底膜的侵襲，并在體內體外促進細胞增殖[12]。除此之外，MMP-9 能調節血管生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的釋放，同時能裂解VEGF 的肝素結構域導致其溶解度增加，促進腫瘤早期新生血管生成。研究證實，在喉癌和舌癌等多種HNSCC 中均發現MMP-9 及VEGF 過表達，尤其在腫瘤侵襲前沿，并且其表達還與血管密度呈正相關。說明在HNSCC 中，MMP-9 通過破壞細胞外基質和促進腫瘤新生血管生成等機制促進其侵襲轉移[35，37，38]。

腫瘤細胞可以通過整合素αvβ6-MAPK/ERK信號通路調控基質金屬蛋白酶MMP-9 的分泌；整合素αvβ6 高表達使MAPK 活性增加，MMP-9 分泌增多，ECM 降解加速，促進腫瘤細胞的侵襲轉移；通過基因突變技術刪除β6 細胞內段ERK 結合位點，可以抑制腫瘤細胞的生長[39]。

3 整合素αvβ6 在HNSCC 的診斷與治療中的應用

由于整合素αvβ6 在健康組織中表達水平難以檢測，但已被證明在HNSCC 中高表達，并且它的高表達通常與腫瘤侵襲和轉移以及患者中位生存時間的顯著縮短有關[40]。因此整合素αvβ6 可以作為HNSCC 腫瘤成像和臨床治療的潛在靶點。它還可作為一種預后預測指標，用于跟蹤腫瘤進展和監測治療。

3.1 整合素αvβ6 在HNSCC 診斷中的應用

細胞外基質中含有RGD 序列的配體結合整合素αvβ6 后將其激活，從而參與細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤細胞粘附和遷移等過程[12]。在成像中，利用整合素αvβ6 高親和力RGD 多肽進行細胞成像，為區分整合素αvβ6 陽性的浸潤性癌細胞提供了一種新的方法。

3.1.1 靶向RGD 多肽用于HNSCC 的定位與腫瘤轉移的追蹤

考慮到整合素αvβ6 在頭頸部骨浸潤性鱗狀細胞癌中高表達，Nieberler 等[1]使用整合素αvβ6靶向RGD 多肽對頭頸部骨浸潤性鱗狀細胞癌進行熒光細胞學成像，結果顯示可以明顯改善術中對切緣的控制。Hanadi 等[12]將18f-半乳糖-RGD 作為PET 顯像劑用于檢測HNSCC 腫瘤的試驗顯示腫瘤攝取高于背景，并且可以檢測到大多數（10/12）原發腫瘤和部分（2/6）淋巴結轉移。另有學者將標記的RGD 四聚體結合近紅外發射量子點，以促進原位頭頸部鱗癌小鼠模型中殘余腫瘤組織的消除。近紅外引導下的手術使無復發生存率提高了50%。Hausner 等[41]成功設計了一種重鉛肽，模擬含RGD 序列多肽。該肽與整合素αvβ6 結合，可以幫助特異性識別高表達整合素αvβ6 的小鼠腫瘤。這些肽被成功地用于口腔鱗癌的手術、診斷或化療中的成像及治療，可幫助確定腫瘤區域。Roesch 等[42]設計了含有RGD 序列的多肽SFLAP3，其在人血清中表現出超過24h 的顯著穩定性。體內外實驗觀察到SFLAP3 對多種高表達整合素αvβ6 的HNSCC 腫瘤細胞系具有較高的親和力和特異性。將68ga-dota 標記的肽成功地作為放射示蹤劑用于PET/CT 掃描，顯示SFLAP3 在HNSCC 異種移植物和患者原發腫瘤病灶中有特異性積聚，從而發現組織學證實的頭頸部鱗癌和相應的淋巴結轉移。上述結果表明在HNSCC 中高表達的整合素αvβ6 對于其特異性成像及診斷具有較高應用價值。

3.1.2 靶向環非肽Tyr2 用于HNSCC 腫瘤的可視化

Quigley 等[43]將優化的整合素αvβ6 選擇性環非肽Tyr2 在TRAP 螯合物核心上進行三聚化合成，然后用Ga-68 自動標記形成Ga-68 Trivehexin。該探針顯示出對整合素αvβ6 特有的高親和力，可從血清中快速清除。在人體PET 成像中，Ga-68-Trivehexin在HNSCC 的原發灶和轉移灶中均顯示出高且持續的攝取。除了腎臟和泌尿道中的排泄物，其他器官未見相關攝取。且排泄物在研究環境中不會影響腫瘤的可視化。這在肝臟和肺等高表達整合素αvβ6的癌的典型原發和轉移器官中效果最為顯著，因為受非特異性攝取的影響顯著減小。與以往的靶向探針相比，Ga-68-Trivehexin 對HNSCC 的形態描述更加準確，并且在受放射影響的周圍組織中攝取不會明顯增加，對腫瘤的精準可視化程度更高。此探針還可以用于對放射治療的早期反應的評估。因此Ga-68-Trivehexin 對于整合素αvβ6 表達升高的頭頸部鱗狀細胞癌的PET 成像具有很高的臨床價值。

3.2 整合素αvβ6 在HNSCC 光熱療法（photothermic therapy, PTT）中的應用

HNSCC 每年在全世界有近70 萬例新發病例和38 萬例死亡病例，傳統的治療方法包括手術、化療及放療等綜合治療[44]。然而這些治療治療方法仍存在較多缺點。手術切除的局限性在于這種方法會切除至關重要功能性組織如部分舌頭，這可能影響患者講話和吞咽功能。放化療對惡性腫瘤組織的特異性較差，容易產生耐藥性和全身副作用。因此，需要開發新的治療方法，使其可以消除癌細胞，同時不會對正常細胞造成損傷和副作用。

PTT 作為傳統癌癥治療方法的替代或補充，其具有創傷小、并發癥少、恢復快的優點，PTT 通過光熱試劑在近紅外光的照射下，不斷吸收熱量，使局部溫度升高，選擇性破壞異常細胞，從而達到治療癌癥的目的[45]。目前PTT 在臨床上主要用于較表淺部位如皮膚病治療。PTT 具有相對選擇性，不毀損容貌和功能，且不良反應少或輕微，治療頭頸部顯露表淺部位的惡性腫瘤有明顯的有利條件。整合素αvβ6 在HNSCC 的發生、發展、轉移和侵襲中起重要的調控作用。所以，對于HNSCC 的治療來說，整合素αvβ6 是一個理想的藥理學靶點。將光熱劑裝載于生物相容性更好的納米顆粒中，并在上面連接靶向整合素αvβ6 的多肽，以HNSCC 中高表達的整合素αvβ6 作為光熱治療的靶點，可顯著提高納米材料的腫瘤靶向能力，更有利于腫瘤的消除。

方少斌等[21]通過實驗證明，使用含有RGD 序列的拮抗劑抑制整合素αvβ6，可以抑制人口腔鱗癌細胞的遷移和生長，并抑制體內腫瘤的生長。這提示整合素αvβ6 可作為HNSCC 成像和治療中的靶點。在PTT 中Legge 等[46]將磁性氧化鐵納米顆粒附上生物相容性二氧化硅涂層，并與靶向整合素αvβ6 的抗體結合，使納米顆粒直接進入過表達整合素αvβ6的HNSCC 腫瘤細胞，利用磁性納米顆粒的加熱特性，將其暴露在交變磁場中，對整合素αvβ6 過表達的腫瘤細胞進行熱消融。通過整合素αvβ6 抗體的靶向作用，磁性納米粒子產生的熱療可以定位于腫瘤生長區域，具有顯著降低副作用和最大限度地減少對健康組織損傷的潛力。在體外實驗中，磁性納米粒子連接抗整合素αvβ6 抗體后，僅在交變磁場中暴露10min，就導致85%的VB6 細胞死亡。相比之下，整合素αvβ6 陰性細胞暴露于相同環境時，細胞活力僅降低20%。這項體外研究表明，通過精心配對抗原、抗體和納米顆粒，磁高熱對高表達整合素αvβ6 的HNSCC 腫瘤細胞的殺傷潛力可以顯著增強。這證明將用于細胞加熱和破壞的磁熱療新興領域與新開發的HNSCC 生物標志物整合素αvβ6 結合在一起，有望形成一種新的靶向治療方法。

4 結局和展望

HNSCC 是一種包括不同解剖區域的異質性腫瘤，即使在多模式治療之后[12]，HNSCC 患者的5 年生存率僅為40%～50%[47]。為了改善晚期轉移性疾病的治療結果和總生存率，發現HNSCC 疾病進展的生物標志物以及進行分子靶向治療都是必要且有重要意義的[48]。

整合素αvβ6 在HNSCC 中表達顯著上調，且與患者生存期相關。大量的研究證明，整合素αvβ6 通過多種致癌信號通路促進HNSCC 腫瘤細胞的侵襲轉移。整合素αvβ6 在HNSCC 發生和發展過程中的表達和重要作用為以整合素αvβ6 為靶點的腫瘤成像和治療提供了可靠依據，整合素αvβ6 成為未來遺傳學和臨床研究的有前途的靶點，以及合適的治療選擇[49，50]。近年來開發了多種靶向整合素αvβ6 的PET 放射性藥物。其中一些已經在人體中進行了測試，甚至已用于臨床試驗，因此強調了靶向整合素αvβ6 的成像在人類癌癥中的臨床潛力[51-54]。

綜上所述，在HNSCC 中表達顯著升高的整合素αvβ6 與腫瘤的侵襲轉移及惡性進展密切相關，并與HNSCC 患者的預后相關，在預判HNSCC 的發展和惡化中具有一定的價值，可作為獨立預后不良指標。且由于整合素αvβ6 在HNSCC 中高表達的獨特性，利用其作為治療靶點，將能選擇性結合整合素αvβ6 的多肽與不同的抗腫瘤藥物結合，提高抗癌藥靶向性和生物利用度。由于其對靶點的準確識別性及非癌細胞不受影響性，能夠極大地提高藥效并削弱不良反應。將能選擇性結合整合素αvβ6 的多肽與光熱劑結合合成納米探針，此探針兼具成像與治療功能，具有腫瘤靶向、藥物緩釋、放射增敏、多藥聯合、無創定位等優勢，有望增強藥物治療效果、減少藥物的不良反應、抑制腫瘤耐藥。同時,由于獨特的腫瘤靶向、光熱效應等物理特性,有望在今后為HNSCC 患者帶來無創定位、基因治療、光熱治療在內的新型診斷和治療方式。