FGF2對礦化誘導下STAT3介導的hDPSCs成牙分化作用研究*

王曄，于淼，魏朝，張丞，馬永平

齲齒或牙髓炎造成的牙體或牙髓組織不可逆性損傷和壞死是臨床上常見的牙齒疾病，因此，牙體或牙髓組織再生在口腔領域一直是研究熱點。人牙髓干細胞（humen dental pulp stem cells,hDPSCs）具有自我更新和多向分化潛能的特點，且來源廣、獲取方便，因此在牙組織再生方面的應用受到全球學者的廣泛關注[1]。Chen 等[2]研究發現，hDPSCs 來源的外泌體通過功能性愈合促進牙髓再生，在再生牙髓中具有潛在應用價值。富血小板纖維蛋白通過激活BMP2/Smads 信號通路可促進hDPSCs 成骨分化[3]。硅酸二鈣可促進hDPSCs 增殖和成骨向分化能力[4]。成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）具有多種生理活性，有報道稱，將編碼FGF-2 的納米復合材料與hDPSCs 共培養，可增強hDPSCs 的增殖活性和礦化特性[5]。Novais A 等[6]研究表明FGF2培養的hDPSCs 植入顱面骨缺損部位可促進顱面骨修復。信號轉導子與激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一種核轉錄因子，在細胞增殖、分化和凋亡過程中具有重要作用[7]，研究發現，抑瘤素M 激活STAT3 誘導hDPSCs 成骨分化，抑制STAT3 后阻斷分化過程[8]。本實驗通過抑制STAT3，探討FGF2 對hDPSCs 成牙本質分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 原代人牙髓干細胞（humen dental pulp stem cells，hDPSCs）株購自美國ATCC 公司，貨號：YS-ATCC813，來源于人的正常牙組織。

1.1.2 試劑和儀器 STAT3 抑制劑Stattic（ 19983-44- 9,Cayman Chemical,美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）試劑盒（ A059-2-2,南京建成）；CCK-8 試劑盒（ C0038，上海碧云天生物技術有限公司）；牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein 1,DMP-1）和牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP）引物序列（廣州銳博生物有限公司）；PCR 逆轉錄試劑盒（RP1200-100，北京索萊寶科技有限公司）；DMEM 培養基和胎牛血清（ 12634010,16000-044，Gibco 公司，美國）；兔抗人FGF2、p-STAT3、STAT3 抗體（ab208687,ab267373,ab68153,Abcam 公司，美國）；茜素紅和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（130-22-3，11-11-11，Sigm 公司，美國）。

熒光定量PCR 系統（QuantStudio,賽默飛世爾科技，德國）；多功能酶標儀（iMark 0601,上海伯樂生命醫學產品有限公司）；恒溫恒濕培養箱（AW100，上海鉑溫儀器有限公司）；垂直電泳儀（ 165-8001，Bio-Rad 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術 檢測hDPSCs 表面標志物hDPSCs 進行常規培養并傳代，0.25%胰蛋白酶消化第3 代hDPSCs，4℃ 3000 r/min 離心10 min，去上清，收集細胞。預冷PBS 漂洗細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL，取100 μL 單細胞懸液于無菌EP 管中，加入FITC 標記的CD29、CD44、CD45、CD90、CD34 和CD31 抗體 4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達情況。

1.2.2 CCK-8 檢測不同濃度FGF2 對hDPSCs 活力的影響 將hDPSCs 以3.0×103個/孔的密度接種于96 孔板，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。細胞貼壁生長后，換用含不同濃度（0、5、10、15、20、25 和30 ng/mL）的FGF2 培養基培養細胞，每個濃度設置5 個復孔，培養至1、5、7 和14 d 時，取出培養板，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，37℃孵育4 h，置于酶標儀上測定450 nm 波長處吸光度（OD 值），計算細胞活力。細胞活力（%）=（實驗組OD 值/空白對照組OD 值）×100%。

1.2.3 實驗分組及細胞活性檢測 將hDPSCs 以3.0×103個/孔的密度接種于96 孔板，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。細胞貼壁生長后隨機分為對照組（僅用礦化誘導液培養）、FGF2 組（含20 ng/mLFGF2 礦化誘導液培養）、Stattic 組（含4 μM Stattic 的礦化誘導液處理30 min，Stattic 溶于DMSO）、FGF2+Stattic 組（含4 μM Stattic 的礦化誘導液處理30 min 后，再換用含20 ng/mL FGF2 的礦化誘導液培養，Stattic 溶于DMSO），礦化誘導液含10% FBS 的DMEM 培養基、1×10-8mol/L 地塞米松、50 μg/mL維生素和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）。參照1.2.2 的實驗方法檢測細胞活性。

1.2.4 qRT-PCR 檢測DMP-1 和DSPP mRNA 相對表達量 將hDPSCs 以6.0×104個/孔的密度接種于6孔板，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長后按照1.5 中的方法進行處理，培養至14 d時，3000 r/min 離心10 min，收集細胞。Trizol 試劑提取細胞中總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄成cDNA，進行PCR 反應，預變性溫度：95 ℃反應30 s，進行1個循環；循環反應溫度：95℃ 5 s、60℃ 30 s，72℃ 45 s，進行40 個循環，以2-△△CT 法計算DMP-1 和DSPP mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 ALP 活性檢測及ALP 染色 將hDPSCs 以6.0×104個/孔的密度接種于6 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長后按照1.5 中的方法進行處理，培養至14 d 時，3000 r/min 離心10 min，收集細胞。

ALP 活性檢測：預冷PBS 清洗，加入RIPA 裂解液，裂解10 min，4℃ 1000 r/min 離心5 min，收集上清液。取5 μL 蛋白樣品或標準品加入到0.9 mmol/L 的2- 氨基-2 甲基-1 丙醇（AMP）緩沖液中，再加入25 μL 磷酸對硝基苯酯中，充分混勻，37℃恒溫孵育30 min，置于酶標儀上，設定波長405 nm，測定吸光度（A）值，ALP 活性以每毫克總蛋白生成1 mol/L 磷酸硝基苯進行量化。

ALP 染色：預冷PBS 清洗，4%多聚甲醛固定20 min，雙蒸水清洗2 次，每孔加入300 μL ALP染液染色15 min，雙蒸水清洗直至無染液殘留，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 茜素紅染色 將hDPSCs 以6.0×104個/孔的密度接種于6 孔板，置于37℃、5% CO2培養箱

中培養，細胞貼壁生長后按照1.6 中的方法進行處理。培養至14 d 時，3000 r/min 離心10 min，收集細胞，蒸餾水清洗3 次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，1%茜素紅（PH 4.2）染色15 min，蒸餾水多次清洗直至把茜素紅染液沖洗干凈，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 蛋白印跡法檢測細胞中FGF2 和p-STAT3蛋白相對表達量 將hDPSCs 以6.0×104個/孔的密度接種于6 孔板，置于37℃、5% CO2 培養箱中培養，細胞貼壁生長后按照1.6 中的方法進行處理。培養至14 d 時，收集各組細胞，裂解，4℃12000 r/min 離心10 min，收集上清液。BCA 法測定蛋白濃度，煮沸變性。12% SDS-PAGE 電泳，將蛋白濕轉至PVDF 膜上，5%胎牛血清室溫封閉，兔抗人FGF2、p-STAT3、STAT3、GAPDH 一抗（1:1000）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1:5000）室溫孵育2 h，ECL 發光液顯色，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值為目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0 統計學軟件分析數據，計量資料均以（±s）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hDPSCs 表面標志物鑒定結果 流式細胞術檢測結果顯示：CD90、CD44 和CD29 呈高表達，陽性率分別為97.46、98.53%、98.28%，而CD31、CD34 和CD45 呈低表達，陽性率分別為0.21%、0.22%、0.28%。見圖1。

圖1 流式細胞術鑒定hDPSCs 表面標志物

2.2 不同濃度FGF2 對hDPSCs 增殖活性的影響 與0 ng/mL 比較，細胞活力在FGF2 5、10、15、20、25 和30 ng/mL 各個時間點均增強，且具有濃度依賴性，從20 ng/mL 以后細胞活力呈下降趨勢，因此選擇FGF2 濃度為20 ng/mL用于后續實驗。見表2。

表2 不同濃度FGF2 對hDPSCs 活力的影響（±s，n=5）

表2 不同濃度FGF2 對hDPSCs 活力的影響（±s，n=5）

注：與0 ng/mL 比較，aP ＜0.05。

FGF2 濃度（ng/mL）細胞活力（%）第1 天第5 天第7 天第14 天100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00 5 115.36±6.33a126.07±9.70a135.42±11.47140.58±11.71 0 10 123.54±12.51 148.24±13.54155.77±13.86163.35±14.73 15 131.59±12.32 155.03±16.42 161.27±16.96169.06±19.34 20 139.64±15.67 163.93±16.33171.55±16.83180.40±16.90 25 140.41±16.72 162.81±17.03163.84±15.49173.54±19.31 30 143.74±14.13 157.49±18.70159.34±16.43166.89±19.39

2.3 CCK-8 檢測結果 與對照組比較，FGF2 組細胞活力在各個時間點均增強，Stattic 組細胞活力在各個時間點均減弱（P ＜0.05）；與FGF2 組比較，FGF2+Stattic 組細胞活力在各個時間點均減弱（P＜0.05）；與Stattic 組比較，FGF2+Stattic 組細胞活力在各個時間點均增強（P ＜0.05）。見表3，圖2。

圖2 第14 天細胞生長情況

表3 FGF2 對hDPSCs 活力的影響（±s，n=5）

表3 FGF2 對hDPSCs 活力的影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與FGF2 組比較，bP ＜0.05；與Stattic 組比較，cP ＜0.05；

組別細胞活力（%）第1 天第5 天第7 天第14 天對照組 100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00 FGF2 組122.67±10.06 144.53±11.18a173.99±9.35 a194.97±11.67 a Stattic 組84.90±5.25 70.63±5.35a 55.67±7.06 a41.65±6.06 a FGF2+Stattic 組111.75±10.37127.82±6.54bc 141.80±10.95 bc 163.89±12.75 bc

2.4 qRT-PCR 檢測結果 DMP-1、DSPP mRNA 相對表達量組間比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與對照組比較，FGF2 組DMP-1 和DSPP mRNA 相對表達量升高，Stattic 組DMP-1 和DSPP mRNA相對表達量降低（P ＜0.05）；與FGF2 組比較，FGF2+Stattic 組DMP-1 和DSPP mRNA 相對表達量降低（P ＜0.05）；與Stattic 組比較，FGF2+Stattic 組DMP-1 和DSPP mRNA 相對表達量升高（P ＜0.05）。見表4。

表4 FGF2 對hDPSCs 中DSPP、DMP-1 mRNA 相對表達量的影響（±s，n=5）

表4 FGF2 對hDPSCs 中DSPP、DMP-1 mRNA 相對表達量的影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與FGF2 組比較，bP ＜0.05；與Stattic 組比較，cP ＜0.05；

組別DSPPDMP-1對照組4.02±0.483.24±0.54 FGF2 組6.73±0.57a7.42±0.65a Stattic 組2.83±0.54a1.62±0.47a FGF2+Stattic 組5.62±0.44bc6.23±0.61bc

2.5 ALP 活性和染色結果 ALP 活性組間比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與對照組比較，FGF2 組ALP 活性升高，Stattic 組ALP 活性降低（P ＜0.05）；與FGF2 組比較，FGF2+Stattic組ALP 活性降低（P ＜0.05）；與Stattic 組比較，FGF2+Stattic 組ALP 活性升高（P ＜0.05）。見表5，圖3。

圖3 ALP 染色 ×40

表5 FGF2 對hDPSCs 中ALP 活性的影響（±s，n=5）

表5 FGF2 對hDPSCs 中ALP 活性的影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與FGF2 組比較，bP ＜0.05；與Stattic 組比較，cP ＜0.05；

組別ALP 活性（U/mg）對照組4.00±0.38 FGF2 組8.83±0.53a Stattic 組2.36±0.46a FGF2+Stattic 組5.73±0.61bc

2.6 茜素紅染色結果 FGF2 組染色較對照組加深，礦化結節增多；Stattic 組染色較FGF2 組減淡，礦化結節減少；FGF2 組染色較FGF2+Stattic組加深；Stattic 組染色較FGF2+Stattic 組減淡。見圖4。

圖4 茜素紅染色 ×40

2.7 蛋白印跡法檢測結果 FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量組間比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與對照組比較，FGF2 組FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量升高，Stattic 組FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量降低（P ＜0.05）；與FGF2 組比較，FGF2+Stattic 組FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量降低（P ＜0.05）；與Stattic 組比較，FGF2+Stattic 組FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量升高（P ＜0.05）。見表6，圖5。

表6 FGF2 對hDPSCs 中FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量的影響（±s，n=5）

表6 FGF2 對hDPSCs 中FGF2、p-STAT3、DMP-1 和DSPP 蛋白相對表達量的影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與FGF2 組比較，bP ＜0.05；與Stattic 組比較，cP ＜0.05；

組別FGF2p-STAT3STAT3DMP-1DSPP對照組 0.23±0.04 0.31±0.06 0.95±0.06 0.26±0.03 0.21±0.04 FGF2 組 0.86±0.07a 0.75±0.06a 0.96±0.04 0.92±0.05 a 0.72±0.05 a Stattic 組0.14±0.06a 0.11±0.05a 0.98±0.06 0.14±0.03 a 0.12±0.03 a FGF2+Stattic 組0.62±0.03bc 0.45±0.04 bc 0.98±0.05 0.73±0.05 bc 0.46±0.04 bc

3 討 論

齲病是在以細菌為主的多種因素影響下，牙體組織發生的一種慢性進行性破壞疾病，發生齲病時，細菌通過牙本質小管侵害牙髓組織，發展成牙髓炎甚至根尖周炎[9]。臨床上常通過去除炎癥牙髓或無機材料填充的方式治療由牙髓創傷或感染造成的牙髓炎或根尖周炎，但傳統治療方法根管治療法存在一定弊端，去除牙髓后由于血運喪失及免疫系統破壞，牙齒脆性增強，抗壓性能下降，根折風險增加[10]。近幾年，有學者提出再生牙髓治療法，即通過再生因子、干細胞等實現牙髓牙本質樣組織再生。hDPSCs 具備間充質干細胞特性，具有高度可塑性和多向分化潛能，在一定刺激因子作用下可分化為成牙本質細胞，形成修復性牙本質，隔斷牙本質小管阻斷外界刺激，從而保護牙髓組織[11]。因此，深入了解hDPSCs 牙本質分化再生機制，找到發揮作用的關鍵因子對治療牙髓炎或根尖周炎至關重要。

FGF2 具有多種生物學功能。體外研究證明，FGF2 可促進間充質干細胞增殖、軟骨分化以及成骨分化，在骨組織再生方面發揮重要作用[12-13]。殼聚糖納米顆粒共轉染BMP2 和FGF2 可增強人脂肪源性基質細胞的成骨能力[14]。體內研究表明，FGF2 可促進兔橈骨骨缺損修復[15]。Yuan等[16-17]研究發現在牙齒發育過程中，細胞纖毛內轉運蛋白可促進細胞增殖、分化和極化，該蛋白缺失的hDPSCs 中，FGF2/FGFR1 信號通路被阻斷，hDPSCs 牙本質分化過程被抑制。根據以上研究結果，我們推測FGF2 在調節骨再生和成骨分化過程中具有重要作用，但是對于FGF2 在hDPSCs 成牙分化過程中的作用知之甚少，本研究通過含不同濃度的FGF2 培養基培養hDPSCs，發現hDPSCs 活力隨FGF2 濃度的增大而升高，且具有時間和濃度依賴性。說明FGF2 可促進hDPSCs增殖活性。之后選用FGF2 20 ng/mL 進行后續實驗。ALP 是一種水解酶，通過促進鈣和無機質結晶沉積形成鈣化參與牙齒、骨骼等礦化組織的形成，隨著細胞分化程度增高，細胞外基質和礦化越多，ALP 活性越高。牙本質是由成熟的牙本質細胞分泌的細胞外基質礦化形成的，細胞外基質包括DMP1、DSPP、骨鈣素等。本實驗結果顯示，含FGF2 20 ng/mL 的培養基培養hDPSCs 14 d 后，ALP 活性增強、DMP1 和DSPP 表達增多、礦化結節明顯，以上結果提示：FGF2 促進hDPSCs 成牙分化過程。

STAT 是一種細胞質轉移因子，被激活發生磷酸化后，2 個STAT 的SH2 結構域相互作用發生二聚化，可將信號由細胞表面傳遞至細胞核內，在細胞增殖、分化和凋亡中發揮重要調控作用，同時參與炎癥反應。體內外實驗均表明，STAT3 缺失造成股骨骨密度、骨強度以及骨形成率降低，骨礦物質含量減少，成骨細胞增殖率降低[18]。STAT3 激活可促進成骨細胞分化和骨形成[19]，Yang 等[20]研究發現STAT3 可調節破骨細胞穩定和分化。但是，STAT3 是否在hDPSCs 成牙分化過程中發揮作用鮮有報道，因此本研究通過STAT3 抑制劑Stattic 阻斷該信號通路，發現hDPSCs 增殖能力降低，DMP-1 和DSPP 表達降低，ALP 活性減弱，細胞礦化能力減弱，說明阻斷STAT3 后，hDPSCs 成牙本質分化能力減弱。而Stattic 對hDPSCs 預處理后，再用含FGF2 的培養液處理，則可使hDPSCs 增殖能力升高，DMP-1和DSPP 表達升高，ALP 活性增強，細胞礦化能力增強，說明FGF2 可削弱STAT3 抑制劑Stattic的作用，增強hDPSCs 成牙本質分化能力。

綜上所述，FGF2 可促進hDPSCs 成牙分化，其可能是通過激活STAT3 通路發揮調控作用，為臨床治療齲齒或牙周炎等疾病提供理論依據。