熒光納米探針在肝癌早期診療的研究進展

熊彥凌，李 菁

1湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410000；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科，湖南 長沙410007

肝癌（HCC）是我國常見的消化系統惡性腫瘤，多因肝細胞或肝內膽管上皮細胞癌變所致。臨床常用手術切除、肝移植、免疫治療、靶向治療及放化療等［1］方法治療肝癌，但仍存在靶向效果差、毒副效果強、確診時間晚以及肝癌細胞的耐藥性等問題。大量研究表明，納米技術的發展能夠有效解決上述問題［2］。目前，肝癌的早期診療主要依賴于MRI、光熱成像、熒光成像和光聲成像，其中熒光成像具備的高敏感度、良好穩定性、低毒性等優勢。熒光納米探針通過熒光成像技術與一項或多項診斷手段整合在同一種納米材料上，對肝癌的早期診療及一體化具有重要意義。本文將對熒光納米探針在肝癌早期診療中的研究進展加以綜述,旨在為未來肝癌的診療提供新思路。

1 熒光納米探針簡介

納米材料是在三維空間中至少有一維處于納米范圍（1～100 nm）或以它們為基本單位構成的材料，具有體積效應、表面效應、量子效應、宏觀量子隧道效應等特性，使得納米材料在生物應用、化學、腫瘤預防與診療［3］等領域獲得廣泛關注。納米探針作為能檢測細胞的新型生物傳感器，在腫瘤的診斷中有著獨特優勢。如納米探針憑借納米尺度的大小和較長半衰期，使其容易穿透腫瘤的內皮細胞，并滯留在腫瘤中（高滲透長滯留效應）［4］；通過納米技術表面修飾與生物結合制成的響應探針可用于實時原位成像［5］；其具有較大的比表面積和大量的活性位點，與特定組織靶向結合，也可以將不同模式的信號分子進行選擇性組合，從而達到高通量、多模態成像目的。

納米材料的光學、可定向合成組裝等自身特性能夠優化熒光成像。常用的熒光染料標記可將腫瘤組織周圍過表達的物質激活發光，腫瘤周圍及正常組織中則實現熒光淬滅［6］，但易表現熒光效率低、光穩定差等缺點。而熒光納米材料會進一步考慮生物相容性、識別、光控、載藥等功能需求，對探針進行修飾組裝，最終有利于生物成像及醫療診斷。與此同時，靶向熒光納米材料通過針對腫瘤細胞過表達的生物標志物特異性激活［7］，能夠精準定位癌癥病灶的邊緣，為肝癌早期診療提供重要依據。

2 特異性靶向探針

在探針上加載腫瘤靶向配體，給予探針選擇性識別腫瘤的能力，能夠有效提升成像的對比度。目前認可的肝癌特異性分子靶點包括上皮細胞黏附分子（EpCAM）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC-3）、血管內皮生長因子、CD44、羧酸酯酶［8］和生物素受體等，這些靶向分子在肝癌早期研究中顯示出較好的效果。

2.1 靶向GPC-3

GPC-3是一種存在于細胞膜表面的肝癌特異性糖蛋白［9］，在正常人體肝細胞中不表達。它的升高與肝癌的發病和預后有很大關聯，是肝癌早期診斷的重要指標。

有學者通過將納米顆粒偶聯多肽片段TJ12P1得到能夠靶向肝癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 的納米探針Ag2S@BSA-TJ12P1。實驗通過近紅外光成像在體成像觀察微小轉移灶。結果顯示GPC-3在肝癌細胞系中均高表達，有利于早診斷肝癌微小轉移病灶［10］。

2.2 靶向生物素受體

生物素作為人體肝臟中含量較多的水溶性維生素B群成員，可與螢光素結合且不會對其生物活性產生干擾，是一種理想的標記物質。

具有熒光激活特性的近紅外（NIR）納米探針在癌癥診斷方面具有優勢，但鮮有報道同時靶向生物素受體和羧酸酯酶用于HepG2腫瘤雙靶向成像的“智能”納米探針。因此，有學者提出一種近紅外熒光探針，研究證實了熒光淬滅納米顆粒NIR-CBT-NP可以有效靶向過表達生物素受體的HepG2細胞，并通過細胞內羧酸酯酶水解激活熒光，用于腫瘤雙靶向成像［11］。

2.3 CD44適配體

CD44是一種跨膜細胞表面糖蛋白，其特征是其變異在人類癌癥中顯示差異過表達［12］。而適配體是一段以高親和力與靶分子專一性緊密結合的單鏈寡核苷酸分子(RNA或DNA)，通過指數富集配體系統進化技術從隨機合成的不同寡核苷酸核酸分子庫中篩選［13］。

有課題組發現的可結合CD44E和CD44s的適配體（CD44-Apt1），與抑制劑5-FU結合后能有效引導5-FU進入肝癌細胞使藥物毒性顯著增強數千倍以上且自身無毒［14］。CD44-apt1以CD44表達依賴的方式有效靶向腫瘤移植，表示其具有作為納米探針提供抗癌治療的潛力。

2.4 TLS11a適配體

TLS11a適配體是一種可內化到細胞內的人肝癌細胞特異性膜蛋白，通過形成酰胺鍵與MFS納米顆粒結合，成為靶向部分。適配體有類似于抗體的識別能力，常被用于以適配體為識別基礎的分析技術，如細胞追蹤、探針傳感技術［15］、電化學細胞傳感器［16］等。

有學者提出的納米探針由帶熒光SiO2殼層的Fe3O4核納米顆粒附著TLS11a適配體組成，大量探針能夠被HepG2細胞所攝取，同時研究表明該探針具有穩定的熒光性質將實現肝癌細胞早期診斷實時成像［17］。有研究提出將鏈霉親和素偶聯熒光二氧化硅納米顆粒與生物素偶聯TLS11a適配體標記的肝癌細胞混合，發現納米探針對癌細胞具有良好的敏感度［18］。靶細胞存在時，由于對HepG2細胞TLS11a適配體的特異性識別，釋放的納米探針能夠引起電化學信號變化。利用適配體傳感技術，有學者設計的電化學細胞傳感器利用形成的g-四鏈體/hemin DNAzyme產生電化學響應，利于肝癌細胞的成像和早期診斷［19］。

核酸適配體通過結構識別以高親和力和特異性靶向細胞表面分子。因此，適配體在靶向肝癌并提高手術療效方面具有很大潛能［20］。有學者篩選出一種單鏈DNA寡核苷酸適配體與內源性糖蛋白有高度親和力，內源性糖蛋白在肝癌細胞和新生血管內皮細胞中均高表達。該探針使得直徑1～4 mm的原位肝癌轉移病灶到可視化，有望通過術中近紅外熒光成像指導腫瘤切除［21］。

2.5 Ep CAM適配體

正常上皮細胞和大多數惡性上皮腫瘤細胞表面表達的Ep CAM可以作為潛在的肝癌干細胞標記物，為循環腫瘤干細胞在肝癌診斷、治療和預后評價的臨床應用提供科學依據［22］。憑借Ep CAM在肝癌內高表達，正常肝細胞內不表達的特性，其有望成為肝癌早期診療的新靶點［23］。

有團隊開發的靶向成像探針由介孔二氧化硅包覆磁性納米顆粒合成，然后通過適當的生物偶聯途徑與Ep CAM適配體和熒光團偶聯［24］。該納米探針通過內吞途徑在Ep CAM（包括HepG2）組顯示出較強的攝取能力，可用于靶向Ep CAM和熒光成像。

3 熒光成像

作為一項利用光學檢測器采集熒光探針發射光從而進行成像的技術［25］，熒光成像技術的應用在肝癌的早期診療方面具有重要意義。

為了觀察到肝癌細胞的物質變化，有學者設計的納米探針選取氮摻雜碳點（N-CDs）和金納米團簇（Au NCs）作為發光納米材料成功合成了Au NCs/N-CDs納米顆粒，實現對水樣化Cu2+的可視化檢測，有望監測體內肝癌細胞內Cu2+的變化，以便盡早發現肝癌［26］。

3.1 近紅外熒光成像

熒光成像包括可見光區熒光成像及近紅外熒光成像。近年來，近紅外熒光成像憑借其組織穿透深、成像速度快、副作用小等優勢引起了學者們的興趣。對比近紅外一區（NIR-I）的熒光成像，近紅外二區的熒光成像具有更深的組織穿透度、更強的時空分辨率等特征，在腫瘤的成像診斷、造影技術等領域有巨大的應用前景［27，28］。如，靶向納米探針近紅外二區成像實現對肝癌早期微小病的灶精準定位。

3.2 雙模態成像

根據不同納米材料獨特的理化性質,納米探針能對病灶部位進行不同模式的成像,如光學成像、磁共振成像、熒光成像、CT等。而雙模態成像可將兩種成像模態結合起來從多角度對肝癌進行評估。

結合光學成像的高選擇特性和超聲成像的強穿透兩者優勢，光聲成像技術成為近幾年發展起來的一種新的生物醫學影像技術［29］。而熒光成像與光聲成像結合更益于幫助患者早期診斷與完整切除。已有研究合成高負載吲哚菁綠的新型熒光納米探針，其作用為描繪肝癌邊緣并在術中區分腫瘤及正常組織。為了在肝癌切除時提供更準確的指導，有研究制備了吲哚菁綠載金核殼納米顆粒Au@liposome-ICG以整合兩種成像策略［30］。事實證明，這種新型的雙模態納米探針對肝癌的早期診斷和治療具有巨大的潛力。

磁共振具有高敏感度、空間分辨率、高對比度和多參數成像等優勢。有學者研發的納米顆粒Gd-REs@Lips可作為T2加權成像造影劑，增加MRI成像上肝癌組織與周圍正常肝組織的信號強度差異；同時可作為近紅外二區陰性成像造影劑，增加肝癌精準檢測的可能性［31］。開發的近紅外二區/MRI雙模態納米探針有望填補腫瘤病變術前成像檢測與術中指導之間的空白，并為進一步應對肝癌帶來新的機遇。

3.3 多模態成像

多模態成像納米探針作為以同時結合多種成像技術為原理而設計的納米探針，為肝癌的早期診斷提供了更加全面而精確的信息，實現在細胞及分子水平對腫瘤進行及時的個性化診斷等［32］。

為了解決單一模態成像帶來的局限性，有研究合成一種多模態納米探針R-GdMFs。該探針利用MRI和NIR成像技術完成了對肝癌小鼠腫瘤的靶向診斷［33］。R-GdMFs隨時間在腫瘤部位富集,通過在不同時間點采集MRI圖像和熒光圖像，發現其具有良好的靶向成像效果，對肝癌小鼠的靶向腫瘤診斷具有潛在的應用價值。

融合多模態成像的探針已廣泛應用于腫瘤的診斷及治療，但鮮有報道多模態診療一體化探針應用在微小肝癌領域。有研究合成的ICG-Gd-CuS@BSA-EpCAM納米探針具有光聲、磁共振、熒光三模態成像特性，未來可能用于術前肝癌的排查以及術中引導腫瘤治療［34］。

4 診療一體化

單一的腫瘤治療常受到三方限制，一是前期不能對腫瘤病灶做到精準定位及診斷；二是對治療過程中的各項指標變化無法有效監控；三是預后對腫瘤部位治療效果的監測。因此，診斷與治療結合更利于腫瘤的治愈。

目前有關肝癌診療一體的研究較多，療法主要包括光動力治療、光熱治療、栓塞治療、放射治療及納米探針輔助載藥等。熒光納米探針將熒光成像技術與多種療法聯合，為癌癥的早期診療帶來新的可能。

4.1 光動力療法

光動力治療指借助光敏劑吸收特定波長光的能量從而產生活性氧（ROS）的治療手段［35］。這種治療手段對腫瘤細胞具有強殺傷性且副作用較少，被廣泛應用于腫瘤治療中。

有研究制備的新型納米探針SPIO/AIE@HA-g-PZLL除具有熒光與磁共振雙模態成像外，還具有良好的光動力療效［36］。研究通過構建的HepG2皮下荷瘤小鼠模型發現在白光照射下攝取納米粒子后的HepG2細胞生成大量ROS且具有較強的細胞殺傷效果。該探針有望在臨床上用于肝癌的雙模態成像引導下的光動力治療。

利用近紅外熒光成像技術與光動力療法實現肝癌的診療一體化。有學者構建一種內含光敏劑且外部包覆肝癌細胞膜的熒光納米探針SSAP-Ce6@CCM，實現了肝癌的診療一體［37］。該探針所用的癌細胞膜結構可改善納米顆粒的穩定性與生物相容性，使得易被同型癌細胞攝取。

4.2 光熱療法

光熱療法通過高光熱轉換效率的物質注入體內，再經定向識別技術將其集中于腫瘤周圍，通過近紅外光將光能量轉變成熱能，從而殺死腫瘤細胞。其中，納米粒子有助于光熱劑靶向腫瘤微環境，實現特定靶向［38］。

有學者使用HCC 特異性多肽SP94、近紅外染料Cyanine5.5 對PBNPs 納米粒子進行修飾，最終合成SP94-PB-SF-Cy5.5［39］。探針實現了索拉菲尼的靶向遞送及溫控釋放，將靶向治療和光熱治療相結合，有效治療小鼠局部的肝癌。光熱治療與緩解缺氧兩種方式結合可刺激機體產生抗腫瘤免疫，減輕免疫抑制作用。該探針有效緩解肝癌預后差、易復發和轉移等問題，開創性地將光熱治療與免疫相聯合，對肝癌治療具有重大貢獻。

有學者擬對肝癌發展過程中的關鍵節點進行光聲成像及關鍵分子功能的在體可視化，合成了具有近紅外二區成像及光熱性能的肝癌特異性靶向納米探針Pt@PDA-c，從而精準進行診斷及光熱治療，為肝癌診療的應用提供新的思路［40］。

4.3 光熱/光動力聯合治療

單一的光治療往往不能徹底根除腫瘤。光熱療法若發生腫瘤各部位受熱不均的情況，腫瘤就不能徹底根除。光動力療法利用ROS殺死腫瘤細胞，但事實上大多數實體腫瘤的缺氧會嚴重限制光動力治療的效率。一些光敏劑的疏水性和腫瘤選擇的局限性也會降低光動力療效。因此，光熱/光動力聯合治療利于提高肝癌的療效及減輕副作用。

為提高熒光納米探針的療效，有研究提出了一種表面修飾CD147的金納米顆粒并負載光敏藥物IR820的納米探針，經體內治療實驗證明其具有良好的光熱/光動力治療效果。該探針的發明對基于納米材料的腫瘤聯合治療尋找新策略具有重要意義［41］。借助聯合治療思路，有課題組設計了金納米顆粒與基質金屬蛋白酶-2偶聯并負載光敏藥物IR820用于肝癌光熱/光動力聯合治療，具有不錯的抗癌能力［42］。

4.4 放射治療

腫瘤放射治療是利用放射線治療腫瘤的一種局部治療方法，成為治療惡性腫瘤的主要手段之一。肝癌的放射治療受限于肝臟對放射的耐受性較低，放射增敏劑可以有效降低所需的輻射劑量，而釓的原子序數較高，常作為腫瘤輻射增敏劑［43］。

有研究開發的AGuIX納米顆粒是一種釓基納米顆粒，可攜帶放射性同位素或熒光標記物用于SPECT、PET、熒光成像［44］。研究人員用64Cu標記AGuIX制成放射性示蹤劑64Cu-AGuIX，在放射治療研究中觀察到，在提前注射AGuIX的裸鼠移植瘤中發現18F-FDG（癌細胞攝取一種葡萄糖類似物）攝取減少。研究證明，AGuIX可以作為PET成像的治療性放射敏化劑來指導肝癌的放療。

4.5 栓塞治療

栓塞治療通過動脈或靜脈導管將塞劑注射進病變組織的供血血管，阻斷病變組織的血液循環，從而達到清除病變組織、控制出血量、治療腫瘤和血管病變的功能。

肝癌的血供十分豐富且栓塞治療易損傷正常肝組織，為了提高肝癌的栓塞準確率，既往研究提出靶向栓塞腫瘤血管的方式來精確栓塞腫瘤。以MnCl2、TMA·OH和H2O2為原料制備的MnO2/BPD納米顆粒能夠測量熒光成像等多種成像信號的變化，同樣也能夠靶向腫瘤新生血管上的低密度脂蛋白受體［45］。在光動力的條件下，該探針能夠觸發凝血瀑布準確栓塞腫瘤血管，有望應用至肝癌的診療一體化。

5 總結與展望

在分子影像學的研究中，熒光納米探針因其具有高敏感度、低毒性、良好靶向性等特點，已越來越多應用于肝癌早期診療領域。納米探針研究不斷深入，但仍存在諸多問題需要探究。納米熒光材料在生物體內存在潛在的生物毒性；部分納米材料易富集且難以降解，影響正常細胞代謝；腫瘤靶向特性的納米藥物如何提高療效和安全性方面等［46］。

隨著納米技術的介入，集靶向運輸、成像監測和藥物治療等功能于一體的診療一體化納米體系極大可能成為未來的研究趨勢。在制備和應用診療一體納米材料的過程中也存在需要進一步研究的問題。如何設計新型高效安全的多功能診療一體化納米材料，實現對腫瘤的精準定位診斷，以及如何建立診療一體化納米材料評估體系與管理準則等問題亟待解決。除此之外，納米顆粒與中藥的交叉應用［47］、納米載體與納米平臺構建［48］、納米藥物遞送系統研發［49］等納米技術在未來也具有很大的潛能，為更好地治愈肝癌帶來無限的可能。