共存抗壞血酸下明膠對花色苷穩定性的影響及機理研究

馬 靜，李 麗，由耀輝，馮治平,

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；2.內江師范學院沱江流域特色農業資源四川省科技資源共享服務平臺，四川內江 641000；3.內江師范學院果類廢棄物資源化四川省高等學校重點實驗室，四川內江 641000）

花色苷是果蔬飲料中重要的功能成分，在賦予飲料鮮艷色澤的同時，還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[1-2]?？箟难幔╒itamin C，VC）與花色苷常共存在果蔬飲料中，二者極易發生相互作用，加速花色苷的降解，導致果蔬飲料的色澤褪變，嚴重影響產品品質[3-4]。迄今，關于VC加速花色苷降解的原因尚未取得共識，被廣泛接受的主流假說有兩種：一是“氧化假說”，即VC的氧化產物促進花色苷降解[5]；二是“縮合假說”，即VC直接與花色苷發生縮合反應[6]。

目前，提高花色苷結構穩定性的方法主要分為兩大類：一是對花色苷分子結構進行修飾[7-8]；二是通過大分子負載，使花色苷和大分子之間以氫鍵、疏水作用、靜電作用等次級鍵結合[9-11]。其中，添加蛋白質是提高花色苷穩定性的有效方法之一，在提高花色苷穩定性的同時，還可以賦予食品額外的營養價值。Türky?lmaz 等[12]發現脯氨酸和花色苷之間的相互作用可以保護花色苷免受VC及其降解產物的降解。Ren 等[10]發現乳清蛋白的加入可以提高含VC飲料中花青素的穩定性，使紫玉米和葡萄花青素半衰期延長約2 倍，黑胡蘿卜花青素半衰期延長約1.31 倍。Zang 等[11]發現在含VC的加速實驗中，乳清蛋白分離物和牛血清白蛋白對花色苷都有不同程度的保護作用。Chung 等[13]發現L-色氨酸通過氫鍵和疏水作用與花色苷相互結合，使含VC模擬飲料中花色苷的半衰期從2 d 提高到6 d。目前的報道多為乳清蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白與花色苷的研究[14-15]，且這些蛋白質多數只溶于堿性環境下，而果汁飲料多為酸性環境，因此存在一定的局限性。明膠作為一類膠原蛋白衍生物，主要來源于動物骨、皮等結締組織[16]，具有成本低，來源廣泛、易于加工、無毒性等特點，常用于食品、醫藥、包裝[17-18]等領域。明膠在酸性環境下有較好的溶解性，有望通過氫鍵、疏水作用、靜電作用等次級鍵與花色苷形成復合物，進而增強花色苷穩定性。然而，目前鮮有關于明膠對花色苷穩定性的研究，更無在VC-花色苷共存體系下的相關報道。

基于此，本文在含VC的模擬飲料條件下研究明膠對矢車菊-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside，C3G）貯存穩定性的影響，通過熒光光譜和分子對接等方法對明膠與VC及明膠與C3G 之間相互作用的結合能力、作用力及作用位點進行了研究，深入分析在VC存在下明膠對花色苷穩定性的保護機制，以期為提高果汁飲料中花色苷穩定性提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品 中原植提標準品經銷中心；明膠 國藥集團；抗壞血酸、山梨酸鉀 上海泰坦科技有限公司；其它常規試劑均為分析純。

UV2000 紫外可見分光光度計 舜宇恒平；F-4600 熒光分光光度計 日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬果汁飲料體系制備 模擬果汁飲料的制備參照Chung 等[13]的方法并略加修改。用去離子水配制0.1 g/L 的C3G 溶液（含0.3 g/L 的VC和0.1 g/L山梨酸鉀）。用去離子水分別配制0、0.05、0.1、0.5、1、2 g/L 的明膠溶液，用磁力攪拌器在50 ℃的水浴中300 r/min 攪拌30 min，使明膠充分溶解。然后將C3G 溶液與明膠溶液按體積比1:1 比例混合，用0.1 mol/L，pH3.0 檸檬酸緩沖溶液調pH 為4，最終得到的模擬果汁飲料體系包含C3G 0.05 g/L、VC0.15 g/L、山梨酸鉀0.05 g/L 以及不同質量濃度明膠（0、0.025、0.05、0.25、0.5、1 g/L）。無VC果汁飲料體系除不加VC外，其余配方比例參照上述方法。

1.2.2 貯存穩定性研究 貯存穩定性實驗根據Jiang 等[19]的方法并進行適當修改。將上述溶液在30 ℃下避光保存，定期取樣測量花色苷的含量，按公式（1）計算降解率，每組實驗平行3 次?；ㄉ蘸坎捎胮H 示差法測定[20]：分別取2 mL 待測樣，用pH1.0 氯化鉀緩沖溶液和pH4.5 醋酸鈉緩沖溶液將樣品稀釋至10 mL，平衡20 min，以純水為空白，分別測定樣液在波長512 nm 和700 nm 處吸光度，按公式（2）計算花色苷含量：

式中：C0表示C3G 的初始濃度，mg/L；Ct表示t d時樣品中C3G 的濃度，mg/L；A 為樣品的吸光度；M為矢車菊-3-O-葡萄糖苷相對分子質量，484.82 g/mol；DF 為稀釋倍數；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26900 L/mol·cm；L 為光程，1.0 cm。

1.2.3 花色苷降解動力學分析 通常，花色苷的降解可運用一級反應動力學模型分析[21]。按公式（3）、（4）計算一級反應速率（k）和半衰期（t1/2）。

式中：C0表示C3G 的初始濃度，mg/L；Ct表示t d時樣品中C3G 的濃度，mg/L；k 為降解速率，h-1；t1/2表示花色苷濃度下降一半所需的時間，h。

1.2.4 熒光光譜分析 熒光分析實驗參照Li 等[1]方法并略加修改。固定明膠濃度為0.5 g/L，在300、310、320 K 條件下分別測定明膠在不同濃度C3G（ 0、 1.03×10-5、 2.06×10-5、 3.09×10-5、 4.12×10-5、5.15×10-5、6.18×10-5mol/L）或是不同濃度VC（0、0.28×10-4、0.56×10-4、1.13×10-4、2.27×10-4、4.54×10-4、9.08×10-4mol/L）作用下的熒光光譜。設置激發波長為280 nm，發射波長為300～450 nm，激發和發射狹縫均為5 nm。

1.2.5 分子對接 采用AutoDock Vina1.1.2 進行分子對接。選擇I 型膠原蛋白（PDB ID：5K31）作為明膠模型物，用Pymol2.3.0 去除蛋白結晶水、原始配體等，將蛋白結構導入AutoDocktools（v1.5.6）進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型等處理。從PubChem 數據庫下載C3G、VC的3D 結構，導入ChemBio3D Ultra 14.0 進行能量最小化，將優化好的小分子導入AutodockTools-1.5.6 進行加氫、計算電荷、分配電荷等處理。最后利用PyMOL2.3.0 對對接結果進行相互作用模式分析。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次，結果以平均值±標準差表示，采用Origin 8.5 繪制圖表，使用SPSS 20.0 進行差異顯著性分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 VC 存在下明膠對C3G 貯存穩定性的影響

由圖1（a）、（b）可知，隨著貯存時間的延長，每組中C3G 的降解率都在不斷增加，但添加了明膠組的C3G 降解率均低于對照組，說明明膠的加入減緩了花色苷的降解，貯存7 d 后，明膠質量濃度為0.025、0.05 g/L 組的C3G 降解率與對照組無顯著差異（P＞0.05），隨著明膠質量濃度的增加，與對照組相比，明膠顯著降低了C3G 的降解率（P＜0.05）。特別是明膠質量濃度為0.5 g/L 的體系中，在貯存7 d 后C3G 的降解率為55.95%，而相同條件下對照組C3G 的降解率為75.86%。這可能是明膠與C3G 形成了復合物，而復合物的形成能將C3G 吡咯環的C2 位置所遮蔽，防止了開環及查爾酮的形成，從而提高了C3G 的穩定性[22]。

圖1 含VC 模擬飲料中不同明膠濃度對C3G貯存穩定性的影響Fig.1 Effects of different gelatin concentrations in simulated beverages containing VC on the storage stability of C3G

2.2 無VC 條件下明膠對C3G 貯存穩定性的影響

在無VC的模擬飲料中，C3G 的降解率也隨時間的延長而不斷的增加，但在相同貯存時間內無VC中C3G 的降解率明顯低于VC存在下C3G 的降解率，說明VC的存在促進了C3G 的降解。在貯存7 d 后，添加了明膠組的C3G 的降解率均高于對照組，說明在無VC存在下明膠不能提高C3G 的穩定性。明膠只在VC存在下對C3G 的降解具有保護作用，因此進一步推測明膠與VC競爭結合C3G 形成復合物，降低了VC對C3G 的可及性，從而提高了C3G 穩定性。之前的研究也有類似的報道，Chung 等[23]研究發現加熱變性的乳清蛋白（WP）能顯著提高紫胡蘿卜花色苷（ACN）在VC存在下的穩定性，并且通過熒光猝滅研究發現ACN 與WP 通過氫鍵形成的相互作用強于VC與WP 的相互作用，WP 的加入增加了WP 與ACN 相互作用，從而降低了VC對ACN 的有效性。因此，在后面的實驗中進一步研究了明膠與C3G 及明膠與VC之間的相互作用。

圖2 無VC 條件下明膠對C3G 貯存穩定性的影響Fig.2 Effect of gelatin on storage stability of C3G in the absence of VC

2.3 VC 條件下C3G 降解動力學

由表1 可知，模擬飲料體系下，C3G 的降解符合一級動力學（R2＞0.9），這與他人的研究結果一致[24-25]。添加了明膠體系中的C3G 的半衰期均有所提高，表明明膠對C3G 在貯存過程中具有一定的保護作用，當明膠質量濃度在0.025～0.5 g/L 范圍內時，隨著明膠質量濃度的增加C3G 降解速率隨之降低，半衰期隨之增加，其中明膠質量濃度為0.5 g/L 的體系中C3G 的半衰期相較于對照組提高了70 h。這可能是當明膠質量濃度較低時，由于VC濃度較高C3G 可能更容易與VC結合，但隨著明膠質量濃度的增加，C3G 與明膠的作用力增強，從而降低了C3G 降解率，增加了C3G 的半衰期[10]。當明膠質量濃度增加到0.5 g/L 時，明膠與C3G 之間的相互作用可能達到了一種飽和狀態，所以增加明膠的濃度對C3G 的降解不再起抑制作用。

表1 不同濃度明膠處理下C3G 降解動力學參數Table 1 Degradation kinetic parameters of C3G under different concentrations of gelatin

2.4 C3G 或VC 對明膠熒光光譜的影響

蛋白質中的發色團為色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，它們因為生色基團的不同分別在348、303、282 nm 波長處出現熒光峰[26]，可用于研究蛋白質與小分子物質之間的相互作用。構成明膠的氨基酸有18 種，由于不存在色氨酸，且苯丙氨酸殘基的熒光極弱且易被猝滅，所以明膠的內源熒光主要來自于酪氨酸[27]。

從圖3 可以看出，明膠在313 nm 處有最大發射波長，隨著C3G 或VC濃度的不斷增加，明膠在313 nm處的熒光強度呈現有規律的降低，這一結果說明C3G 和 VC均與明膠之間發生了相互作用，且明膠的最大發射波長發生了不同程度的紅移，這可能是C3G 或VC與明膠中親水的側鏈殘基之間發生了相互作用，導致明膠分子中酪氨酸殘基所處的微環境及分子構象行為發生變化，使所處環境的極性增強，疏水性降低，親水性增強[28]。C3G 與VC是水溶性物質，可與蛋白質的親水性側鏈殘基發生相互作用從而使得蛋白質的肽鏈變得更加伸展，從而使得蛋白質的構象發生變化[29]。

圖3 不同濃度C3G（a）和VC（b）對明膠熒光光譜的影響Fig.3 Effect of different concentrations of C3G (a) and VC (b)on the fluorescence spectra of gelatin

2.5 C3G 與明膠相互作用的熒光猝滅機理研究

熒光猝滅可以分為由靜態猝滅和動態猝滅，可以用Stern-Volmer 曲線來判斷淬滅機理是靜態還是動態[10]。

式中：F0為未加入C3G 時明膠的熒光強度；F 為加入C3G 時明膠的熒光強度；Kq為雙分子猝滅速率常數（L/（mol·s））；Ksv為猝滅常數（L/mol）；[Q]為C3G 的摩爾濃度（mol/L）；τ0為無C3G 時蛋白質的平均熒光壽命（一般認為平均壽命約為10-8s）[27]。各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數約為2.0×1010L/（mol·s），若猝滅常數大于最大擴散猝滅速率常數，則猝滅可認為是靜態猝滅；相反，則可以被認為是動態猝滅[30]。

根據式（5），以F0/F 為縱坐標，對[Q]進行線性擬合，繪制得圖4，從而計算出C3G 與明膠相互作用的動態猝滅常數（Ksv）和生物大分子猝滅速率常數（Kq）。

圖4 不同溫度條件下C3G 與明膠的Stern-Volmer 曲線圖Fig.4 Stern-Volmer graph of C3G interacting with gelatin at different tempuratures

從圖4 和表2 可以看出，F0/F 與[Q]具有很好的線性關系，所以C3G 與明膠只存在一種猝滅關系。對于動態猝滅而言，Ksv通常會隨著溫度的升高而增加；但對于靜態猝滅，Ksv通常會隨著溫度的升高而減小，但有時也會存在增加的情況，它會受蛋白質和猝滅劑之間的相互作用力的影響[31]。本研究中隨著溫度升高，動態猝滅常數Ksv略有升高，但是明膠與C3G 相互作用的Kq值卻遠高于最大擴散猝滅速率常數（2.0×1010L/（mol·s）），說明C3G 對明膠的猝滅機理仍然是C3G 與明膠結合形成穩定復合物所引起的靜態猝滅。

表2 不同溫度條件下C3G 與明膠相互作用的猝滅常數Table 2 Quenching constants of the interaction between C3G and gelatin at different temperatures

2.6 VC 與明膠相互作用的熒光猝滅機理研究

VC與明膠相互作用的猝滅機理研究方法參照C3G 與明膠的方法。

根據式（5），以F0/F 為縱坐標，對[Q]進行線性擬合，繪制得圖5，從而計算出VC與明膠相互作用的動態猝滅常數（Ksv）和生物大分子猝滅速率常數（Kq）。

圖5 不同溫度條件下VC 與明膠的Stern-Volmer 曲線圖Fig.5 Stern-Volmer graph of VC interacting with gelatin at different tempuratures

從圖5 和表3 可以看出，F0/F 與[Q]具有很好的線性關系。隨著溫度升高，動態猝滅常數 Ksv略有升高，但是明膠與VC相互作用的Kq值比最大擴散猝滅速率常數（2.0×1010L/（mol·s））高出一個數量級，說明C3G 對明膠的猝滅機理是VC與明膠結合形成基態穩定復合物所引起的靜態猝滅。與明膠-VC相比，明膠-C3G 的Ksv值更高，說明明膠與C3G 之間的作用力更強[30]。

表3 不同溫度條件下VC 與明膠相互作用的猝滅常數Table 3 Quenching constants of the interaction between VC and gelatin at different temperatures

2.7 分子對接

選擇I 型膠原蛋白作為明膠的模型物與C3G、VC進行分子對接，結果如圖6 所示。研究表明，當結合能小于0 時，表明受體蛋白與配體分子可自行結合；當結合能小于-4.0 kcal/mol 時，表明兩者有一定的對接活性；當結合能小于-5.0 kcal/mol 時，對接活性較強；當結合能小于-7.0 kcal/mol 時，對接活性強烈[32]。因此，C3G 與明膠的結合能為-7.0 kcal/mol，證明具有較好的結合作用。VC與明膠的結合能為-5.4 kcal/mol，結合作用一般。這表明C3G 與明膠的結合能力強于VC與明膠的結合能力，與前文熒光光譜的研究結果一致。進一步分析二者作用力和作用位點發現，C3G 與明膠的作用力是氫鍵和疏水作用，在ARG-39 位點形成氫鍵，氫鍵的長度為2.4?，在ILE-27、PRO-30、SER-29、PRO-37、ALA-38、ASP-43、ASP-59、GLN-62、ASN-65 位點形成疏水作用；抗壞血酸與明膠的作用力同樣是氫鍵和疏水作用，在ALA-182、ALA-169、LEU-170 位點形成氫鍵，氫鍵的長度分別為2.2?、2.5?、2.8?、2.1?，在ARG-181、LEU-171、HIS-105 位點形成疏水作用。

圖6 C3G（a）和VC（b）與明膠分子對接圖Fig.6 Docking diagram of C3G (a) and VC (b) with gelatin molecule

3 結論

研究表明VC的存在促進了C3G 的降解，而明膠的加入能有效抑制含VC模擬飲料中C3G 的降解，其中明膠質量濃度為0.5 g/L 的效果最好，可使C3G 的半衰期從121 h 延長至191 h。熒光分析表明，C3G 與 VC均能與明膠形成復合物從而導致明膠熒光發生靜態猝滅，且C3G 與明膠的結合常數遠大于VC與明膠的結合常數。分子對接也證實了明膠與C3G 的結合能力強于明膠與VC的結合能力，且兩者與明膠的作用力都主要是氫鍵及疏水作用。因此推測明膠的加入增加了明膠與C3G 之間的相互作用，從而降低了VC對C3G 的降解作用，提高了C3G 的穩定性。本研究可延長含VC飲料中花色苷的貯存穩定性，對含有花色苷和VC的果汁飲料具有潛在的應用價值。