銅脅迫下吊蘭的生理響應及對銅的吸收特性*

謝曉霄，徐 劼，方學雷，溫豪駿

(嘉興學院生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001)

由人類生產、生活所引發的環境重金屬污染問題，已成為全球關注的熱點環境問題之一[1]。重金屬作為一類有害物質，能借助在環境中的遷移、轉化及在生物圈的蓄積對動植物產生毒害作用并最終通過食物鏈對人體健康構成潛在威脅[2]。植物修復技術是借助植物的吸收作用來去除環境中污染物的一種環境友好型的原位處理技術[3]。在相關實驗研究中，通常會選用水培法來評價植物對重金屬的耐性及吸收累積特性。

觀賞植物應用于重金屬污染環境的修復，一方面不會對環境造成二次污染，另一方面也不會因食物鏈而危及人體健康，因此在近年來得到了人們的廣泛關注。吊蘭屬于百合科吊蘭屬，為常見觀賞植物，具有環境適應生存能力強、易栽培等特點。本研究以吊蘭為實驗對象，通過水培實驗探究銅脅迫下吊蘭的生理響應及對銅的吸收特性。研究結論能為重金屬銅污染地區的環境治理與修復提供參考依據。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

試劑：硫酸銅、硝酸、鹽酸、高氯酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、無水乙醇、丙酮。以上試劑均為分析純，購置于上海國藥集團化學試劑有限公司。

儀器：FA1204B型電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TDZ5-WS臺式低速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；JC-FW-100植物粉碎機，青島聚創嘉恒分析儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；iCE 3500型原子吸收分光光度計，賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

采用實驗室水培開展，新購買的吊蘭幼苗于空白營養液中預培養3周(營養液配方參照文獻配制[4])，當根系達到一定長度后開始Cu2+脅迫(CuSO4)處理。選取長勢一致的吊蘭幼苗作為后續實驗對象，Cu2+脅迫實驗共設置4個處理組，水培營養液中Cu2+的濃度分別為0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和60 mg/L。每5 d更換1次營養液，培養周期為25 d。每個實驗處理均設三組平行，所有實驗結果均為三組平行實驗結果的平均值。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生理特性指標

吊蘭葉片中葉綠素含量的測定參照乙醇-丙酮提取法測定[5]：稱取各實驗處理組經洗凈、剪碎的新鮮吊蘭葉片0.1 g于比色管中，隨后加入10 mL丙酮∶乙醇(1∶1體積)混合液于暗處放置24 h后，最后提取液在波長663 nm、645 nm下利用分光光度計測定吸光度，以1∶1丙酮-乙醇混合液為空白，最后計算葉片中葉綠素的含量。

吊蘭根和葉片組織中丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[6]：稱取實驗各處理組吊蘭根或葉片組織樣品1 g于研缽中。隨后加入2 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂，研磨至勻漿后再加8 mL三氯乙酸進一步研磨后進行離心(4000 r/min 10 min)處理。取離心上清液2 mL(對照為2 mL去離子水)，加入2 mL 0.6% 硫代巴比妥酸溶液，混勻物于沸水浴上加熱反應15 min，迅速冷卻后再離心。最后取上清液，分別于532 nm、600 nm和450 nm波長下的吸光度，根據公式計算吊蘭根和葉片組織中丙二醛的含量。

1.3.2 吊蘭根和葉片組織中銅含量的測定

Cu2+脅迫處理實驗結束后，將不同Cu2+脅迫處理組吊蘭根和葉分別洗凈并烘干處理。稱取烘干的吊蘭根或葉片組織樣品0.1 g于150 mL三角瓶中，利用HNO3-HCl-HClO4法消解完全[7]；1% HNO3定容后利用原子吸收光譜儀測定并根據公式計算吊蘭根和葉片組織中的銅含量水平。

2 結果與討論

2.1 銅脅迫對吊蘭葉片葉綠素含量變化的影響

葉綠素是植物進行光合作用的物質基礎，其在對光能的吸收及轉化過程中作用巨大，因而其含量變化是反映植物光合作用正常與否的關鍵指標[8]。在不同Cu2+濃度脅迫處理的第5 d、10 d、15 d、20 d和25 d，對吊蘭葉片葉綠素含量水平進行了測定，實驗結果如圖1所示。

圖1 銅脅迫對吊蘭葉片葉綠素含量變化的影響Fig.1 Effects of copper stress on chlorophyll content in Chlorophytum leaves

從圖1可以看出不同Cu2+濃度脅迫對吊蘭葉片葉綠素含量隨培養時間的變化存在不同的影響。當水培液中不含Cu2+時，隨著培養時間的延長吊蘭葉片中葉綠素的含量增加明顯，與培養第5 d的數據相比，在培養的第25 d吊蘭葉片葉綠素的含量水平增加了54.54%。當水培液中Cu2+的濃度為15 mg/L時，隨著培養時間的延長吊蘭葉片葉綠素含量呈現先增大后降低的變化趨勢，在水培的第15 d葉綠素含量水平最高(1.22 mg/g)，這說明在短期內低濃度的Cu2+脅迫對吊蘭的光合過程存在促進作用。銅是植物生長的必需元素之一，因而體系中適量銅的存在對吊蘭的生長起到了一定的促進作用。但相關研究也表明體系中過量銅的存在會造成植物葉色色失綠，并最終影響植物生長[9]。本實驗研究也觀察到類似結果，當水培液中Cu2+濃度進一步增大(30 mg/L和60 mg/L)，隨著培養時間的延長Cu2+脅迫導致葉片葉綠素含量呈明顯下降趨勢；與培養第5 d的數據相比，在培養的第25 d吊蘭葉片葉綠素的含量水平分別降低了36.70%(30 mg/L)和67.57%(60 mg/L)；這說明高濃度的Cu2+脅迫對吊蘭光合過程存在明顯的抑制作用。研究認為這主要是源于體系中過量存在的Cu2+會與諸如8-氨基乙酰丙酸合成酶、原葉綠素酸酯還原酶和膽色素原脫氨酶的-SH結合，使得這些在葉綠素合成過程中起關鍵作用的酶因結構發生改變而失效[10]。也有研究表明體系中過量存在的Cu2+會對葉片細胞中的葉綠體結構直接產生破壞作用，從而導致葉綠素含量的降低[9]。

2.2 銅脅迫對吊蘭根和葉組織中丙二醛含量變化的影響

本實驗在不同Cu2+濃度脅迫處理的第5 d、10 d、第15 d、第20 d和第25 d，對吊蘭根和葉組織中丙二醛的含量水平進行了測定，實驗結果如圖2和圖3所示。

圖2 銅脅迫對吊蘭根組織中丙二醛含量變化的影響Fig.2 Effect of copper stress on malondialdehyde content in Chlorophytum root

圖3 銅脅迫對吊蘭葉片組織中丙二醛含量變化的影響Fig.3 Effects of copper stress on malondialdehyde content in Chlorophytum leaves

在污染環境下，存在于植物器官組織細胞膜中的不飽和脂肪酸會在氧自由基的氧化作用下反應生成丙二醛，其結果是由于細胞質膜的氧化損傷而導致其選擇性功能弱化及喪失[11]。因此在逆境脅迫環境下，植物器官組織細胞膜的氧化及變性程度強弱可用其組織細胞中丙二醛含量的多寡來評判[12]。由圖2數據可以看出，空白對照處理組(Cu2+濃度為0 mg/L)中隨著水培時間的延長，吊蘭根組織中的丙二醛含量變化不明顯(3.05～3.29 μmol/g)，說明在正常水培條件下吊蘭根系組織能正常生長。當水培液體系中添加了Cu2+后，由于Cu2+的脅迫作用使得根系組織中丙二醛的含量增加，并且表現為60 mg/L>30 mg/L>15 mg/L。水培前期(<20 d)，在各Cu2+添加水平條件下，吊蘭根系組織中丙二醛含量增加不明顯；但培養后期(>20 d)，在高Cu2+添加水平條件下(30 mg/L和60 mg/L)，吊蘭根系組織中丙二醛含量增加明顯。這說明隨著培養時間的延長，高濃度Cu2+脅迫對吊蘭根系組織的毒性作用更加明顯。

由圖3數據可以看出，當Cu2+濃度為0 mg/L時，吊蘭處于正常生長狀態因而葉片組織中丙二醛含量波動不大(5.05～5.72 μmol/g)。當水培液體系中添加了Cu2+后，隨著水培過程的進行，吊蘭根系吸收的Cu2+會轉運至葉部?？梢院苊黠@的看出，由于Cu2+的脅迫作用使得吊蘭葉片組織中丙二醛的含量顯著增加，同樣表現為60 mg/L>30 mg/L>15 mg/L。而且在各Cu2+添加水平條件下，一方面葉片組織中的丙二醛含量水平均高于根組織中的含量(圖2)；另一方面，在整個水培實驗階段吊蘭葉片組織中丙二醛的含量均隨著培養時間的延長而不斷增大。這說明在相同濃度Cu2+水培條件下，吊蘭葉片組織對Cu2+脅迫作用的響應敏感性高于根系組織。

2.3 不同銅濃度處理對吊蘭根和葉Cu含量的影響

Cu2+脅迫處理實驗結束后，將不同脅迫處理組吊蘭根和葉組織中的銅含量水平進行了測定，實驗結果如圖4所示。從圖4可以看出，在同一Cu2+濃度脅迫條件下，吊蘭根組織中的銅含量水平均明顯高于葉片組織。隨著Cu2+濃度的增大，根組織中銅的含量水平也顯著增高；而三個Cu2+濃度脅迫水平下，吊蘭葉片組織中的含量水平則變化不明顯。這說明對于吊蘭而言，根系是外界銅蓄積的主要器官組織，吊蘭根系吸收的銅向地上部的轉運有限，從而盡可能的減少對植株地上部的毒害作用。

圖4 不同Cu2+濃度處理條件下吊蘭根和葉部銅含量的變化Fig.4 Changes of copper content in roots and leaves of Chlorophytum under copper stress

植物種類不同，根系吸收的銅向地上部轉移的能力也存在較大差異。如研究發現對大多數植物物種而言銅富集能力最強的是根系組織，而葉片對銅的富集能力最弱，這是植物對銅脅迫的一種適應性表現[13-16]。這與本實驗研究結論相一致。當然某些植物因體內存在一些特殊的轉運蛋白或特定的可溶性Cu伴侶，因而可將根系吸收的銅向植株地上部轉運并輸送至葉片組織[17]。如研究發現銅脅迫環境下，向日葵幼苗地上部的最高銅含量水平可以是根系組織含量水平的4倍[18]。

3 結 論

以吊蘭為實驗對象，采用水培法研究了不同濃度Cu2+脅迫對吊蘭光合作用、根和葉組織中丙二醛含量變化的影響及吊蘭對銅的吸收特性。實驗結果表明：短期內低濃度Cu2+脅迫(15 mg/L)對吊蘭的光合過程存在促進作用，高濃度Cu2+脅迫(30 mg/L和60 mg/L)對吊蘭光合過程存在明顯抑制作用；由于Cu2+的脅迫作用使得吊蘭根、葉片組織中丙二醛的含量顯著增加，并且隨著培養時間的延長高濃度Cu2+脅迫作用對吊蘭根系組織的毒性作用更加明顯；在相同濃度Cu2+水培條件下，吊蘭葉片組織對Cu2+脅迫作用的響應敏感性高于根系組織；不同濃度Cu2+脅迫條件下，吊蘭根組織中的銅含量水平均明顯高于葉片組織，并且隨著Cu2+濃度的增大，根組織中銅的含量水平也顯著增高，而葉片組織中的銅含量水平則變化不明顯。