乳及乳制品中黃曲霉毒素檢測技術研究進展

楊 帆，黃建輝，陳 琛，關書會，劉廣鵬，張 巖*

（河北省食品安全重點實驗室，國家市場監管重點實驗室（特殊食品監管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050227）

黃曲霉毒素是一種來源于自然界中霉菌的毒素，已經被證明可導致人類癌癥。近年來，健康飲食觀念隨著生活水平的提高逐漸深入人心，乳及乳制品由于富含維生素、鈣、鉀以及蛋白質等營養成分成為人民青睞的健康食品，但部分存在黃曲霉毒素污染問題，這對國民健康構成極大威脅，因此加強黃曲霉毒素殘留的檢測對于把控乳及乳制品質量安全具有十分重要的意義。目前常用的測定黃曲霉毒素殘留方法有薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法、液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法、光譜法、電化學法、快速檢測試紙條法等。本文就黃曲霉毒素來源及危害、國內外限量標準、檢測方法等方面進行綜述，為進一步開展乳及乳制品中黃曲霉毒素檢測技術發展提供思路。

1 黃曲霉毒素的來源與對人體的危害

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉等某些菌株產生的雙呋喃環類毒素，是Ⅰ類致癌化學物質[1]。1960年，英國10 萬只火雞死于一種不為人知的疾病，經過研究證實當時用作火雞飼料的花生餅在其種植、貯藏、加工或運輸環節可能被黃曲霉菌污染，其產生的“黃曲霉毒素”造成火雞的死亡，自此，黃曲霉毒素受到科學家的特別關注[2]。

黃曲霉毒素基本結構為二呋喃環和香豆素，物理化學性質相當穩定，難溶于水，對光和弱酸穩定，強堿或270 ℃高溫下才會發生分解[3]。黃曲霉毒素在濕熱環境中最為常見，易存在于土壤和動植物中，尤其是富含脂肪酸的稻谷、玉米、豆類、堅果、牛乳及乳制品、食用植物油制品等。目前已經發現了20多種黃曲霉素素，一般分為B族（黃曲霉毒素B1（aflatoxin，AFB1）、AFB2）、M族（AFM1、AFM2）和G族（AFG1、AFG2），其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在農產品中較為常見，它們的分子結構相似，可根據自身熒光顏色分類，B代表藍色，因為暴露于紫外線時會發出藍色熒光；G代表綠色，因其在紫外光下發出黃綠色熒光而得名[4]；M的意思即是“牛乳”，貯存條件不當的飼料最易被黃曲霉毒素破壞，奶牛在長期攝食污染黃曲霉毒素的飼料后，極易出現抵抗力降低和營養不良的現象，給奶農造成嚴重損失[5]，少部分會分別轉化為AFM1和AFM2進入乳汁。

黃曲霉毒素具有致突變性，由于本身不能引起突變，必須在機體內經過代謝活化后才具有致突變作用，稱為間接致突變物，能使人成纖維細胞發生程序外DNA合成，動物實驗可見染色體畸變、斷裂和缺失[3]。

黃曲霉毒素是一種劇毒的致肝癌物質，毒性遠高于氰化物、砷化物和有機農藥，有很強的急性毒性，也有顯著的慢性毒性[6]，其中AFB1在污染食品中含量最高，毒性和致癌性也最強，對人體健康危害最大，可引起細胞錯誤修復DNA，導致嚴重的DNA誘變，還可抑制DNA和RNA的合成，從而抑制蛋白質的合成[7]。人攝入大劑量的黃曲霉毒素后可出現肝實質細胞壞死、膽管上皮細胞增生、肝脂肪浸潤及肝出血等急性病變，前期癥狀為發燒、嘔吐、厭食、黃疸，繼而出現腹水，下肢浮腫并很快死亡[6]。慢性中毒表現為生長障礙。肝臟出現亞急性或慢性損傷，體質量減輕，誘發肝癌[8]。AFM1會以含有AFB1新陳代謝物的方式加入生乳和乳制品中，而AFB1效應的重要靶臟器為肝臟，是引起肝癌最重要的原因之一[9]。2017年10月27日，世界衛生組織國際醫學研究機構發布的致癌物清單開始匯總使用，黃曲霉毒素首次被列入致癌物清單。

2 黃曲霉毒素國內外限量標準研究

在食品安全越來越被重視的當下，黃曲霉毒素限量的安全性也引起國內外高度關注，各個國家和地區對于乳與乳制品中黃曲霉毒素的限量都有明確法律規定（表1）。

表1 部分國家或地區黃曲霉毒素限量標準對比Table 1 Aflatoxin limit standards in some countries and regions

通過我國與歐盟、日本、美國等其他國家的限量標準比較可以看出，歐盟是制定標準最為嚴苛的地區[10]。我國黃曲霉毒素限量標準根據產品類別不同設置各自的限量數據，此種做法更為嚴謹，也更符合我國居民食物消費量和健康保護水平。并且我國黃曲霉毒素的限量水平是以保護消費者健康作為首要目標，與國際食品法典委員會和美國標準水平保持一致，尤其是嬰幼兒食品和乳制品[10]。

近年來黃曲霉毒素越來越被重視，各個國家和地區對其標準要求趨于嚴格，更應關注限量變化動態，及時跟進與評估。

3 黃曲霉毒素檢測方法研究

黃曲霉毒素的分析方法已被廣泛開發應用，主要分析方法有以下幾種：TLC、LC-MS、光譜法、電化學法、快速檢測試紙條法等，尋找高特異性和強實用性的檢測方法是未來的發展方向。不同方法適用于各自特定情況，因此需要綜合考慮測定目的、條件和要求再選擇合適的方法：例如，黃曲霉毒素的天然或誘導熒光有助于其檢測，在TLC法中會與掃描儀器結合，根據熒光光斑強弱測定黃曲霉毒素含量；HPLC與MS或其他技術結合的方法，是實驗室常規使用的測定方法；快速檢測試紙條法通常使用黃曲霉毒素的特異性抗體，在現場檢測領域有著十分重要的應用。

3.1 TLC

TLC是黃曲霉毒素分析中最廣泛使用的檢測方法之一，高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography，HPTLC）是最有效和精確的檢測方法之一，二者在國標方法中都有使用。TLC的原理是將經過前處理的樣品在薄層分離后，再根據其自身受光照后熒光的強弱來測定其含量。

Hamed等[11]利用高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）開發了同時測定乳與乳制品中8 種黃曲霉毒素的方法，實驗發現，該方法在優化條件下對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均取得良好的定性及定量效果，方法回收率為82%～104%。Shuib等[12]利用免疫親和柱去除樣品中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，隨后又使用Hypersi gold C18柱分離AFM1，結果表明，當甲醇作為流動相后，AFM1的峰面積增加67%，當采用柱后光化學衍生法測定AFM1時，檢出限由0.013 μg/L降到0.002 μg/L，線性范圍為0.004～0.500 μg/L。隨后Shuib等[13]又建立了一種同時測定AFB1、AFB2、AFM1、AFM2的方法，該法使用Hypersil gold C18色譜柱在40 ℃環境下對黃曲霉毒素進行分離，4 種黃曲霉毒素可在35 min內完全分離，檢出限分別為0.005、0.003、0.004、0.004 ng/mL，回收率為73.0%～109.6%。

TLC法的優點是可以在單個測試樣品中同時檢測幾種類型的黃曲霉毒素，但檢驗過程對技術人員的操作熟練程度有要求，同時檢測設備昂貴、測定時間過長、復雜樣品預處理繁瑣、低濃度峰形不好等都限制了TLC法在實驗室的應用，同樣也不適用于現場檢測。

3.2 LC-MS

LC-MS法檢測精度高、靈敏度高、再現性好，是實驗室測定黃曲霉毒素的常規定量方法。GB 5009.24—2016《食物中黃曲霉毒素M族的測定方法》和GB 5009.22—2016《食物中黃曲霉毒素B族和G族的測定方法》都使用了LC-MS檢測黃曲霉毒素。LC-MS借助黃曲霉毒素的同位素內標物實現對黃曲霉毒素的精準分析，合適的前處理方法和提取劑可以提高精準度。

宗萬里等[14]研究了一種無需使用免疫親和柱的前處理方法，直接在牛乳中添加乙腈，直接將渦旋振蕩離心后的上清液用質譜測定，該法簡便、快速、成本低，應用于大批量樣品中AFM1的快速測定。Zhang Yi等[15]開發了一種特異性好的誘導劑功能化的吸附劑，其與AFM1特異性結合，再經過萃取和洗脫后便可質譜檢測。華宇等[16]通過甲醇提取牛乳樣品上清液，并使用MycoSepTM226 AflaZon＋Multifunctional凈化柱，再通過同位素內標進行基質校準，迅速完成凈化過程，大大提高檢測效率。Du Lijing等[17]將二氧化硅微粒和甲醇用作吸附劑和解吸溶劑來凈化、富集乳中的AFM1和AFB1，再通過質譜對AFM1和AFB1含量加以測定，獲得了良好的效果。Mehta等[18]使用含有體積分數2%甲酸的低溫乙腈來提取乳中黃曲霉毒素殘留，并對其進行水浴、低溫冷藏、離心、干燥、復溶等步驟，再利用LC-MS測定殘留含量。曹葉中等[19]研究了一種快速、成本較低的前處理方案，首先使用含0.5%乙酸的乙腈溶液用作提取劑，再使用硫酸鎂和氯化鈉溶液來促使分層，最后用LC-MS測定殘留量。張俊等[20]將甲醇用作提取液，經離心、稀釋后使用免疫親和柱凈化，最后將待測液洗脫優化后測定，檢驗結果滿足靈敏度要求。

此外，黃曲霉毒素還可采用間接方法進行測定。Perez等[21]開發了一種基于間接生物素化抗體的免疫分析方法，當牛乳中含有AFM1時，金納米顆粒就會游離出來被電感耦合等離子體質譜檢測，由此間接測定殘留含量。

上述各方法的指標參數見表2。

表2 各檢測方法的線性范圍、檢出限和回收率Table 2 Linear ranges, detection limits and recoveries of LC-MS for AFTs

LC-MS的優點是具有精確的檢測結果，但因為其使用免疫親和柱和黃曲霉毒素同位素內標物，成本昂貴，因此只適用于定量檢測，不適用于大批量樣品檢測。LC-MS未來發展方向應該著重放在開發外標方法及研究新的普通固相萃取柱或磁性吸附材料。

3.3 光譜法

目前有研究機構正在利用光譜法測定食物中的黃曲霉毒素，包括熒光光譜法、紅外光譜法和其他光譜法，這些方法在測定牛乳中的黃曲霉毒素時取得了較好的效果。光譜法具有特異性高、檢測速度快等優勢，但也因適配體傳感器制備過程復雜、必須使用DNA試劑等因素制約了自身的發展應用。

3.3.1 熒光光譜法

Li Guangming等[22]利用水熱法制備出高發光率氮摻雜的碳點，將其與堿性磷酸酶聯合使用研制出一種基于碳點內濾效應的無標記免疫傳感器，高量子產率的碳點大大提升了傳感器的靈敏度，牛乳中AFM1的檢出限低至0.018 6 ng/mL。郭婷等[23]將羥基熒光素修飾的適配體用作識別器，將具有猝滅性和磁分離性的Fe3O4納米材料用作熒光猝滅劑，適配體在遇到AFM1時會從Fe3O4表面脫附，熒光信號就會增強，以此測定樣品中的AFM1，檢出限為0.02 μg/L。Li Hui等[24]通過晶種生長法制備了尺寸為33 nm的鈀納米顆粒，通過其與5-羧基熒光素間的熒光共振能量轉移建立新方法，優化條件后的AFM1檢出限為1.5 pg/mL。Jia Yongmei等[25]使用季胺化四苯基乙烯鹽、氧化石墨烯和AFB1適配體制備一種無標記的熒光適配體傳感器，此方法無需熒光素進行標記，簡化流程，提升效率，測定AFB1的檢出限為0.25 ng/mL。Guo Xiaodong等[26]使用羥基熒光素標記核酸適配體，再加入氧化石墨烯猝滅其熒光，同時氧化石墨烯還可保護適配體不被核酸酶裂解，當適配體與AFM1結合后會從氧化石墨烯表面脫離，且在酶的作用下裂解，核酸適配體重新放光，從而實現對AFM1的定量測定，檢出限為0.05 μg/kg。Niazi等[27]將時間分辨熒光納米顆粒用作信號針，將石墨相氮化碳納米片用作熒光猝滅劑，利用滾環擴增技術實現樣品中AFM1測定，即便同時存在AFB1和AFB2，其結果也不會被干擾。Zhou Yaofeng等[28]將量子點珠用作競爭抗原的載體，因為尺寸為150 nm的量子點珠能夠降低競爭抗原對抗體的親和力，熒光信號強度得以增強，在檢測時首先用AFB1-牛血清蛋白在量子點珠表面標記，再結合酶聯免疫技術和熒光法測定乳及乳制品中AFM1含量。Qiao Qinqin等[29]使用羧基熒光素修飾的核酸適配體，并使用羧基四甲基羅丹明猝滅基團修飾與適配體互補的DNAs，二者雜交后DNAs的猝滅基團將導致核酸適配體熒光猝滅，當樣品中含有AFM1時，AFM1優先與核酸適配體結合導致熒光信號再現，最佳條件下檢出限為0.5 ng/mL。

3.3.2 紅外光譜法

紅外光譜法檢測黃曲霉毒素時只需將樣品制片，不需要復雜的前處理過程；與色譜儀和質譜儀相比，紅外光譜儀成本更低。Jha等[30]首先使用傅里葉變換紅外分光光度計和化學計量學建立牛乳樣品中AFB1的定量檢測方法，然后使用同樣方法測定牛乳中的AFM1也取得了良好效果，在650～1 800 cm-1和3 499～3 689 cm-1波數范圍內光譜圖峰形顯著，檢出限低至0.02 μg/L。

3.3.3 其他光譜法

Lerdsri等[31]基于局域表面等離子體共振原理，結合納米金顆粒（AuNPs）開發了一種無標識的比色傳感器，氯化鈉的存在會促使該傳感器利用適配體與AFM1和AuNPs產生聚集效應，由聚集AFM1的體系表面等離子體共振峰移導致溶液由紅色轉變為紫色甚至深藍色，從而實現比色法測定AFM1含量。Jalalian等[32]將AuNPs和適配體分別用作比色劑和探針，將基于鏈霉親和素包裹的二氧化硅納米顆粒、AuNPs與適配體制備成互補鏈傳感器，當被測樣品中AFM1濃度高時呈紅色，反之呈紫色。Tsounidi等[33]利用白光反射光譜研發了一種微型光學免疫傳感器，該傳感器由測量裝置和生物芯片構成，測量裝置包括反射探針、光源和光譜儀，生物芯片是將AFM1-牛血清蛋白結合物固定在SiO2的硅芯片，該傳感器可測定各種品種乳中AFM1，并且樣品無需稀釋和處理。

3.4 電化學法

電化學法在檢測領域被廣泛使用，其優點為成本低、測定迅速、靈敏度高。電化學法通常間接測定黃曲霉毒素含量，方法一是利用適配體與黃曲霉毒素結合產生的復合物阻礙電極表面電子傳遞，通過電化學傳感器的電阻變化來實現黃曲霉毒素的定量檢測[34]；方法二是黃曲霉毒素可將事先固定在電極表面的物質置換出來，通過該物質的氧化還原反應來間接檢測黃曲霉毒素[35]。

Ahmadi等[36]在鉛筆芯電極表面固定還原氧化石墨烯和金納米顆粒，再將其浸泡在乙硫醇改性的適配體溶液1 h后得到特異性傳感器，因為AFM1會使電化學傳感器電阻變大，便可通過電化學阻抗法間接測定AFM1。Smolko等[37]將玻碳電極放置在含中性紅、硝酸鉀和十羧基苯甲酸基柱芳烴溶液中掃描19.5 周，最后用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide，EDC/NHS）技術將AFM1適配體固定在電極表面，制成一種特異性測定AFM1的電化學傳感器。Shadjou等[38]把石墨烯量子點、α-環糊精和銀納米微粒固定到玻碳電極表面，當AFM1含量增加時，電流值也隨之上升，測定成效也令人滿意。Hamami等[39]在絲網印刷電極表層固定AuNPs，再固定二茂鐵四乙二醇配體，最后通過EDC/NHS對其修飾后，便可利用電化學阻抗法靈敏測定AFM1。Rahmani等[40]利用電沉積將AuNPs固定到由靜電紡絲碳納米纖維制作的新型襯底電極表面，再將單鏈DNA修飾到電極表面制得特異性傳感器。Aissa等[41]利用絲網印刷電極和二茂鐵和硅納米粒子構成的適配體制備的電化學傳感器，在使用循環伏安法和電化學阻抗法測定乳中AFM1時靈敏性優異。Karczmarczyk等[42]將巰基丙酸固定在覆金的絲網印刷電極表面，再通過EDC/NHS作用固定牛血清蛋白-AFM1結合物，最后將其浸泡在乙醇胺溶液中凈化，該傳感器在測定乳中AFM1時效果良好。

電化學法具有靈敏度高、線性范圍廣、檢出限低、損耗低等優勢，但其在穩定性和再現性上表現不佳，很難實現多種黃曲霉毒素的同時測定。

3.5 快速檢測試紙條法

快速檢測試紙條法具有操作簡單、成本較低等優勢，因此在現場檢測領域發揮著極其重要的作用。試紙條法適用于現場大批量樣品快速檢測，一旦發現陽性樣本則取樣帶回，利用實驗室定量檢測方法對結果進行核實，大大提高檢測效率，降低檢測成本。

Su Zixian等[43]利用可標記AFM1單克隆抗體的材料制備免疫層析檢測試紙條，以此進行牛乳中AFM1的測定，檢出限低至0.1 pg/mL，靈敏度較高。Han Miaomiao等[44]制備了獨特的單克隆抗體和受體，其與AuNPs結合形成8 對抗體-受體偶聯物和相應半蛋白偶聯物的組合，從而實現1 支試紙條同時測定8 種黃曲霉毒素殘留，此方法AFM1的檢出限為0.016 ng/mL。此外還有Li Miao等[45]制備了時間分辨熒光微球免疫層析試紙條，蔡芬等[46]制備了膠體金單克隆抗體復合物試紙條，Kasoju等[47]利用微流控制分析裝置制備了免疫試紙條，以上檢測方法在最佳實驗條件下測定牛乳中的AFM1時，檢出限最低為0.019 ng/mL。

試紙條法在檢測中不需專用儀器，不需復雜前處理，整體用時較短，操作簡便易學，對檢測人員需求少、要求低，所以非常適用于大批量樣本的現場快速檢測。但試紙條法只適合于定性檢測，其檢測精度低，有效性差，再現性差，在定量檢測上性能明顯不足。

4 結 語

本文比較了國內外各國黃曲霉毒素限量標準的差異，匯總了乳及乳制品中黃曲霉毒素的各項檢測技術，闡述了近年來主要應用的TLC、LC-MS、光譜法、電化學法、快速檢測試紙條法等檢測技術最新研究進展，分析了各類檢測技術的優點及其存在的問題，并對今后測定乳與乳制品中黃曲霉毒素檢測技術的發展方向做出以下預測：1）特異性好、成本低廉的快速檢測試紙條法非常適宜用作大批量樣本快速篩查手段，配合讀數儀便可迅速獲得定性結果和含量數據，實現乳與乳制品中黃曲霉毒素的在線檢測，此種檢驗方法將在生產企業原料驗收或食品抽檢監測等現場快速檢測時發揮重要作用；2）定量檢測的未來導向是開發簡便、適宜的前處理方法，例如，不需要免疫親和柱的方法，無需復雜操作就可快速分離、富集樣本中的黃曲霉毒素，再配合使用自動化程度較高的質譜法或色譜法，就能夠實現大批量樣本快速、簡便、精準的定量檢驗；3）其他檢測方法的未來導向主要有以下兩方面：光譜法的發展方向是開發特異性強、性能穩定、制備簡便的適配體傳感器；電化學法的發展方向是開發各種高靈敏度修飾電極。這2 種檢測方法都能夠有效提升檢測效率，保證檢測穩定性和靈敏度，同時明顯節約檢測成本。