花生KNOX 基因家族的全基因組鑒定及組織表達分析

宋曉峰魯成凱董曉娜高曉東孫熙文付春

(濰坊市農業科學院，山東濰坊 261071)

同源異型盒基因家族(homeobox gene family)編碼一類含有同源異型盒結構域的轉錄調控因子。 同源異形盒基因首先在果蠅突變體研究中發現并命名[1-2]，隨后發現該基因家族在動物、植物、真菌中廣泛存在[3-7]。 同源異型盒基因的典型特征是含有一段高度保守的DNA 序列，長度約180 bp，其編碼的60個氨基酸殘基在三維空間上形成一個三螺旋區結構域。 根據蛋白質的結構特征，通常將植物同源異形盒蛋白分為14 類，其中KNOX(knotted1-like homeobox)和BELL 屬于非典型同源異型盒蛋白，其同源異型盒區的螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ之間多3個氨基酸殘基(Pro-Tyr-Pro)，從而組成TALE(three amino-acid loop extension)同源異型盒蛋白超家族[8]。

KNOX基因廣泛存在于植物中[3]，其編碼的蛋白質具有四個結構域，分別為KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox KN[9]。 植物中第一個KNOX基因KNOTTED-1(Kn1)在玉米中發現，起控制細胞分化作用[10]。 隨后在玉米、水稻、擬南芥、小麥、棉花、豆科植物等中發現大量KNOX基因[11-20]。 研究者根據基因家族成員所編碼蛋白的結構域序列相似性及表達模式，將玉米中KNOX基因家族分為兩個亞家族——Class Ⅰ和Class Ⅱ[21]。 在表達模式上，Ⅰ類KNOX基因亞家族成員主要在分生組織中特異性表達，通過參與調節細胞分化，進而影響組織器官的形態建成[22-23]及控制籽粒大小[24]；Ⅱ類KNOX基因亞家族成員在各組織器官中普遍表達[21]。 擬南芥中Ⅰ類KNOX基因有 4個， 包括STM(At1g62360)、KNAT1(At4g08150)、KNAT2(At1g70510)、KNAT6(At1g23380)，其中，STM對莖尖分生組織的形成以及功能維持起重要作用[25]，KNAT1能夠激活細胞分裂素的合成[12]；Ⅱ類KNOX基因也有4個，即KNAT3(At5g25220)、KNAT4(At5g11060)、KNAT5(At4g32040)、KNAT7(At1g62990)，由于突變體表型缺乏，對其功能研究相對較少。

我國是世界上最大的花生生產國，花生單產是世界花生單產的2.31 倍[26]。 花生是我國重要的油料作物，總產居油料作物之首。 鑒于花生基因組龐大，遺傳背景相對復雜，其分子生物學研究相對滯后于其他豆科植物，如大豆、蒺藜苜蓿等。但隨著栽培種花生基因組序列信息的公布，這種局面正在改變。 本研究在全基因組水平上對花生KNOX基因家族成員進行鑒定，并對其序列特征、進化關系和表達模式進行系統分析，以期為解析花生KNOX基因的重要作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 AhKNOX 全基因組鑒定

栽培種花生(Arachis hypogaeaL.)參考基因組、蛋白序列及注釋文件來自花生數據庫(https://www.peanutbase.org/)。 擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)KNOX基因家族成員數據下載自TAIR 網站(http:/ /www.arabidopsis.org/)。 以擬南芥的8 條KNOX 蛋白序列(STM、KNAT1 ～KNAT7)為種子序列，利用TBtools v1.108[27]軟件的Blast 命令(E-value＜e-5)，在全基因組水平檢索花生蛋白數據庫中候選KNOX 蛋白成員，并刪除冗余序列。 為保證候選成員的真實性，利用NCBI-CDD 和Pfam 在線工具進一步鑒定，去除不包含結構域的序列。

利用ProtParam 網站預測每個KNOX 成員的蛋白理化性質，具體包括氨基酸(amino acid，AA)數、分子量、等電點和親水性，并在Softberry 網站上利用ProtComp 9.0 工具預測其亞細胞定位。

1.2 AhKNOX 基因結構與染色體定位分析

利用TBtools v1.108 的VisualizeGene Structure(Basic)工具對花生KNOX家族成員進行基因結構分析，Gene Location Visualize From GTF/GFF工具進行染色體定位分析。

1.3 AhKNOX 基因家族成員蛋白保守基序與結構域分析

利用MEME 工具對花生KNOX 成員的保守基序進行在線預測，設置基序數目為10，其他參數為默認值；蛋白保守基序和CDD 預測的結構域利用TBtools v1.108 的Gene Structure View(Advanced)工具繪制。

1.4 AhKNOX 基因家族成員系統發育分析

利用軟件MEGA 5[28]的“ClustalW”程序對花生與擬南芥的KNOX基因家族成員進行多重序列比對，參數選擇默認。 并選擇鄰接法(Neighborjoining，NJ)構建系統發育樹，相關參數設置如下:計算距離的替代模型(Substitution Model)選擇泊松校驗(Poisson correction)，Bootstrap 1 000 次。導出.nwk 文件利用FigTree v1.4.4 軟件進行美化并參考擬南芥KNOX基因家族的分類系統，劃分亞家族和亞組。

1.5 AhKNOX 啟動子順式作用元件分析

根據花生基因組數據，提取AhKNOX基因轉錄起始位點上游2 000 bp 的序列作為啟動子區，并遞交至PlantCARE 數據庫，檢索并篩選潛在的順式作用元件，并利用TBtools v1.108 的Basic Biosequence View 工具進行可視化。

1.6 AhKNOX 全生育期及非生物脅迫下表達模式分析

從NCBI 下載花生22 種不同組織的RNA-seq數據(PRJNA291488)[29]，分析AhKNOX基因的時空表達模式。 基于非生物脅迫處理下的RNA-seq 數據(PRJNA553073)，分析AhKNOX基因逆境脅迫下的表達模式。 具體處理如下:分別用1% NaCl、20%PEG6000、20 mg/L ABA、1% H2O2、125 mg/L 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MJ)、高溫(HT，37 ℃)以及低溫(LT，4 ℃)處理幼苗24 h。 RNA-seq 數據通過Hisat2、Samtools 和Cufflinks 分析得到FPKM 值。 將FPKM 值轉化為log2(FPKM)，使用TBtools v1.108 制作表達譜的熱圖。

1.7 AhKNOX 在模擬干旱脅迫下的RT-qPCR驗證

根據轉錄組數據分析篩選2個顯著響應PEG脅迫的AhKNOX基因進行RT-qPCR 分析。 以濰花8 號為試驗對象，2023年2月1日催芽，2月4日定植于水培盒利用Hoagland 溶液在人工氣候箱(上海一恒，MGC-300H)中培養，2月14日發育至三葉期時開始處理。 用 18% (W/V)PEG6000 做脅迫處理，處理3 d 后換回Hoagland營養液復水培養2 d；對照組用不含PEG6000 的Hoagland 溶液培養。 分別于處理0、1、2、3、4、5 d采集根，液氮速凍后用于總RNA 的提取。 利用MolPure?Plant RNA Kit 試劑盒(19291ES50)提取RNA，用Thermo Scientific Fermentas 反轉錄試劑盒(K1622)獲得cDNA。 RT-qPCR 分析采用SYBR?Green real-time PCR Master Mix (TOYOBO)在ABI 7500 FAST 平臺上進行，以Ahactin11為內參基因，利用NCBI 的Primer-BLAST 進行引物設計(表1)，每個樣品3 次重復。

表1 RT-qPCR 引物信息

2 結果與分析

2.1 AhKNOX 全基因組鑒定

經過比對搜索，在花生基因組數據庫中共鑒定到26個AhKNOX基因(表2)。 理化性質預測結果顯示，AhKNOX基因編碼的氨基酸長度差異較大，最短為139 aa(arahy.ZTJV1A.1)，最長為478 aa(arahy.TRGC7G.1)，分子量對應為最小16 116.39 Da、最大52 987.90 Da。 除arahy.ZTJV1A.1 編碼的蛋白質等電點達到8.63 外，其余KNOX 蛋白等電點均低于7，為酸性蛋白。 所有編碼的蛋白均為親水性蛋白，亞細胞預測分析表明所有編碼蛋白均定位于細胞核，符合轉錄因子細胞核定位的特征。

表2 花生KNOX 基因家族信息

2.2 AhKNOX 基因結構與染色體定位分析

對AhKNOX在染色體上的具體分布進行可視化分析，結果顯示除2、12、18 號染色體外，Ah-KNOX在其余17 條染色體上均有分布(圖1A)。AhKNOX基因結構分析發現，各成員基因含有的外顯子數目范圍為2 ～8個，其中，arahy.ZTJV1A.1的外顯子最少，為2個；arahy.TRGC7G.1 含有的外顯子最多，達到8個(圖1B)。

圖1 花生KNOX 基因在染色體上的分布及基因結構

2.3 AhKNOX 系統進化分析

利用擬南芥、花生的KNOX 氨基酸序列構建進化樹，KNOX基因家族蛋白可以分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩個亞家族，每個亞家族又可分為A 和B 兩個亞組(圖2)。 其中12個花生KNOX 蛋白與擬南芥STM、KNAT1 歸為Class ⅠA 組；4個花生KNOX 蛋白與擬南芥KNAT2、KNAT6 歸為Class ⅠB 組；2個花生KNOX 蛋白與擬南芥KNAT7 歸為Class ⅡA 組；8個花生KNOX 蛋白與擬南芥KNAT3、KNAT4、KNAT5 歸為Class ⅡB組。 所有花生KNOX 蛋白進化樹末端的分支均有2個成員，且一個來自染色體1 ～10(四倍體A基因組)，另一個來自染色體11～20(四倍體B 基因組)，兩者為直系同源基因關系。

圖2 花生與擬南芥KNOX 基因家族系統進化分析

2.4 AhKNOX 基因家族成員蛋白保守基序與結構域分析

利用MEME 在線工具對AhKNOX 進行保守基序分析，結果顯示除arahy.ZTJV1A.1 外，其他KNOX 蛋白家族成員都含有Motif3；除arahy.JCQF9U.1、arahy.FU8PR5.1 外，其他KNOX 蛋白家族成員都含有Motif1；Motif5、Motif9 只在Class Ⅰ亞家族中存在，Motif4 只在Class Ⅱ亞家族中存在。 這可能說明不同分支的KNOX基因在花生中發揮不同功能。

利用CDD 工具檢測保守結構域，結果顯示，26 條花生KNOX蛋白有20 條同時具有4個典型的結構域，即KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox_KN；有5 條具有3個結構域，其中arahy.D6DE6U.1、arahy.EUX0L6.1、arahy.4NTH9K.1、arahy.C7XUBI.1 缺少ELK 結構域，arahy.FU8PR5.1 缺少Homeobox_KN 結構域；僅arahy.ZTJV1A.1 只含有Homeobox_KN 和ELK 兩個結構域(圖3)。

圖3 花生KNOX 基因家族成員蛋白保守基序與結構域

2.5 AhKNOX 啟動子順式作用元件分析

為了更好地研究AhKNOX表達調控機制，提取AhKNOX家族成員上游2 000 bp 的基因組序列并預測可能的順式作用元件。 結果顯示各成員的啟動子區域均含有大量的順式作用元件，而且數量與種類存在明顯差異(圖4)。 26 條AhKNOX基因共預測到51 種元件，主要涉及植物生長發育及光、脅迫、激素響應四大類。 其中，光響應相關元件最多，包含Box 4、G-box、GT1-motif 等22種；其次為植物生長發育相關元件，包括種子特異性元件(RY-element)、胚乳表達元件(GCN4_motif)、O2-site(玉米醇溶蛋白代謝調節元件)、分生組織表達元件(CAT-box)等15 種元件，說明Ah-KNOX基因廣泛參與植物生長發育調控。 激素響應相關元件包括脫落酸響應(ABRE)、茉莉酸甲酯響應(CGTCA-motif、TGACG-motif)、水楊酸響應(TCA-element)、生長素響應(TGA-element、AuxRR-core)、赤霉素響應(P-box、GARE-motif)等8 種元件。 逆境脅迫相關元件包括ARE(厭氧誘導)、TC-rich repeats(防御與脅迫壓力)、MBS(干旱誘導)、LTR(低溫響應)、GC-motif(缺氧誘導)和WUN-motif(創傷響應)6 種元件，推測部分AhKNOX基因參與逆境脅迫響應。

圖4 花生KNOX 啟動子順式作用元件分析

2.6 AhKNOX 全生育期及非生物脅迫下表達模式分析

利用22個花生組織轉錄組測序數據，構建了25個AhKNOX基因的FPKM 值熱圖，如圖5A 所示，而arahy.0VJ2KM.1 未檢測到表達。 與玉米研究成果相似[17]，AhKNOX基因的表達模式與其蛋白質進化分類呈現出較強一致性。 Class Ⅰ類基因主要在莖尖、果針等組織特異性高表達。 同一個基因在營養莖尖、生殖莖尖表達豐度趨于一致；入土前果針、入土后果針表達豐度趨于一致；但arahy.D6DE6U.1、arahy.EUX0L6.1、arahy.EP4LC1.1、arahy.VD5ZG0.1 在莖尖、果針表達豐度差異較大，推測這4個基因在花生果針與莖尖分生組織的形成以及功能維持上出現了功能分化。 arahy.B0V7RI.1、arahy.V2YWYI.1 在花器官中表達豐度較高，arahy.U5Q1QL.1、arahy.Z81W9B.1、arahy.EDBH1H.1、arahy.F9ETHR.1 在花生莢果發育初期表達豐度較高。 Class Ⅱ類基因在不同組織及發育時期均有表達。

圖5 花生KNOX 基因表達熱圖

為探究不同非生物脅迫處理下AhKNOX基因的表達模式，利用NaCl、PEG6000(模擬干旱)、低溫、高溫、過氧化氫、ABA、茉莉酸甲酯處理下花生幼苗期葉片和根組織轉錄組測序數據，采用TBtools 構建相對表達量的熱圖。 結果顯示部分基因受非生物脅迫影響，表達量較對照變化較大(圖5B)。 其中一些基因參與特定脅迫下的應答，如arahy.VD5ZG0.1 在鹽和低溫脅迫下的根中表達大幅上調，arahy.EP4LC1.1、arahy.F9ETHR.1 在干旱脅迫下的根中表達大幅上調，arahy.EUX0L6.1在H2O2處理下的根中表達大幅上調，arahy.ZTJV1A.1 在高溫脅迫下的根中表達大幅下調，推測部分AhKNOX基因參與花生抗逆響應。

2.7 PEG6000 處理下AhKNOX 表達分析

基于轉錄組數據篩選得到兩個能夠特異性響應PEG 處理的AhKNOX基因(arahy.EP4LC1.1 和arahy.F9ETHR.1)，為探究其具體響應規律，用18%的PEG6000 處理3 d 后復水2 d，通過RTqPCR 分析其表達模式。 結果(圖6)顯示，arahy.EP4LC1.1 和arahy.F9ETHR.1 均特異性響應PEG脅迫，但響應模式不同。 arahy.EP4LC1.1 隨著處理時間的延長表達量呈逐漸降低趨勢，復水2 d能夠恢復到正常水平；arahy.F9ETHR.1 的表達在處理1 d 后下調，處理2 d 上調至2.5 倍，處理3 d表達量又下降但仍顯著高于對照，復水2 d 后仍顯著低于正常表達水平。

圖6 arahy.EP4LC1.1(A)和arahy.F9ETHR.1(B)在PEG6000 處理下的表達分析

3 討論與結論

KNOX基因家族作為一類轉錄因子，廣泛參與植物生長發育調控。 隨著高通量測序技術的發展，KNOX 轉錄因子家族已在多種植物中鑒定出來，但目前尚未見對花生KNOX基因的研究報道。本研究第一次在花生全基因組水平上對KNOX基因家族進行了鑒定，并對其基因結構、蛋白質保守結構域、系統進化、基因表達模式進行分析，可為進一步研究AhKNOX基因的功能奠定基礎。

本研究共鑒定出26個花生KNOX基因家族成員，數量與同為豆科植物的大豆(27個)相近[30]、遠多于模式植物擬南芥(8個)。 擴充了的AhKNOX基因家族，可以滿足花生特有器官發育、復雜環境適應等其他功能的細化需求。 對花生KNOX 蛋白保守結構域分析發現，除6個Ah-KNOX 蛋白外，其余AhKNOX 蛋白均含有4個典型結構域；arahy.ZTJV1A.1 僅含有Homeobox_KN結構域和ELK 結構域，arahy.FU8PR5.1 缺少Homeobox_KN 結構域，但兩者在果針入土前后有較高的表達。 果針為花生屬特異性組織器官，推測這兩個基因在果針發育中發揮一定的功能，具體機制有待進一步研究。

AhKNOX在花生22個組織中的表達豐度分析顯示，Class Ⅰ類基因主要在莖尖、果針等組織中表達，其中4個與擬南芥STM基因直系同源的基因在莖尖和果針處表達豐度差異較大。 擬南芥中STM在莖尖分生組織的形成以及功能維持中發揮作用，進一步研究這4個KNOX基因在花生莖、果針發育過程中的功能分化，將有助于理解花生果針發育的特殊性。

植物KNOX基因不僅調控生長發育，還可以響應不同非生物脅迫[31-32]。 本研究對AhKNOX家族成員的啟動子順式作用元件進行分析，發現AhKNOX基因除了有保守的光響應元件外，還包含多種不同的逆境脅迫相關元件，推測該家族基因在花生響應植物逆境脅迫中存在功能分化。 利用7 種非生物脅迫處理的花生轉錄組數據對Ah-KNOX基因家族表達模式進行進一步分析，發現有5個基因參與某特定脅迫下的應答，如arahy.EP4LC1.1 和arahy.F9ETHR.1 特異性響應干旱脅迫。 RT-qPCR 驗證結果顯示這兩個基因在PEG處理及復水后表達均發生顯著變化。 這些基因在花生應對干旱脅迫中的具體作用有待進一步研究。