綠刺蛾屬和黃刺蛾屬線粒體基因組研究進展

閆久陽 靳瑞欣 周云威 張秀英

摘要 鱗翅目刺蛾科綠刺蛾屬和黃刺蛾屬幼蟲俗稱“洋辣子”，它們常危害果樹、綠化樹木、農作物等，在我國已被報道有危害現象的共有9種。線粒體基因組的測序為害蟲防治工作奠定了基礎。綜述褐邊綠刺蛾和黃刺蛾的線粒體基因組的提取和分析的方法，并對兩者的線粒體基因組的結構特征、蛋白質編碼基因、tRNA基因、rRNA基因、非編碼區（控制區和基因間隔區）、基因重疊區以及基因重排現象進行了概述，同時總結了這2個屬的線粒體基因組的測序進展，并對未來的測序工作提出了一些展望。

關鍵詞 綠刺蛾屬；黃刺蛾屬；線粒體基因組

中圖分類號：Q812 文獻標識碼：B 文章編號：2095–3305（2023）07–0001-04

綠刺蛾屬Parasa和黃刺蛾屬Cnido-campa，兩者均隸屬于動物界Animalia、節肢動物門Arthropoda、昆蟲綱Insecta、鱗翅目Lepidoptera、刺蛾科Limacodidae，其中，綠刺蛾屬世界已知253種[1-2]，我國已記載46種[3]；黃刺蛾屬世界已知7種，我國已記載4種[4]。

綠刺蛾屬和黃刺蛾屬昆蟲對大量果樹和綠化植被造成嚴重危害，其中我國已報道中國綠刺蛾Parasa sinica（Moore）、麗綠刺蛾Parasa lepida （Cramer）、褐邊綠刺蛾Parasa consocia （Walker）、雙齒綠刺蛾Parasa hilarata （Staudinger）、兩色綠刺蛾Parasa bicolor （Walker）、跡斑綠刺蛾Parasa pastoralis （Butler）、水稻綠刺蛾Parasa oryzae Cai、漫綠刺蛾Parasa ostia （Swinhoe）、黃刺蛾Cnidocampa flavescens （Walker）[5–13]對果樹、綠化樹木、農作物等的危害較為嚴重；二者的低齡幼蟲常聚集分布在葉片的背面，取食葉肉保留葉脈，隨著幼蟲的成長漸漸開始分散取食，可將葉片全部吃光或只保留葉柄，嚴重影響樹木生長，造成減產。

線粒體是大多數真核生物的能量生產車間，是有氧呼吸的主要場所，具有雙層膜結構，是半自主細胞器。近年來，隨著基因測序的不斷發展和完善，少數的綠刺蛾屬和黃刺蛾屬的線粒體全基因組被測定。據Genbank數據庫統計，綠刺蛾屬有一種（褐邊綠刺蛾Parasa consocia （Walker））線粒體基因組被提交（Sun 2019報道Parasa tessellata的線粒體基因組），但在Genbank顯示未被證實[14]其線粒體基因組的完整序列，因此此處不對其進行綜述。黃刺蛾屬有一種（黃刺蛾Monema flavescens Walker）線粒體基因組被提交。

本篇綜述了2種刺蛾（褐邊綠刺蛾的登錄號為KX108765，黃刺蛾的登錄號為NC_032683）線粒體基因組的提取和分析方法、基因結構特征、蛋白質編碼基因、tRNA基因、rRNA基因、非編碼區（控制區和基因間隔區）、基因重疊區以及基因重排現象，分析綠刺蛾屬和黃刺蛾屬線粒體基因組獨特的線粒體基因特征，為進一步了解綠刺蛾屬和黃刺蛾屬的分子進化、系統發育研究提供更多的證據，從而為2種刺蛾屬害蟲的防治工作奠定基礎。

1 測序方法

PCR擴增和測序：根據其他的鱗翅目昆蟲線粒體基因組序列設計的引物集[15-16]（表1）擴增整個線粒體基因組。PCR的基本條件：94 ℃下3 min，94 ℃下30 s進行35個循環，52～60 ℃下1～3 min，72 ℃下10 min。擴增過程在Mastercycler梯度下進行，反應體積為50μL。PCR擴增后由瓊脂糖凝膠電泳（1%，w/v）分離，并用DNA凝膠提取試劑盒進行純化，純化后的PCR產物連接到T載體，測序至少3次。

序列拼接、注釋與分析：序列注釋使用NCBI BLAST和DNAStar packag（DNAStar Inc. Madison， WI， USA）軟件進行。使用tRNAscan-SE程序對tRNA基因進行識別、驗證[19]。使用Clustal X對各種鱗翅目線粒體基因組的PCGs進行比對[20]。偏度計算公式如下：AT skew = （A-T）/（A+T）；GC skew = （G-C）/（G+C），密碼子使用MEGA 6.03軟件進行計算。使用Tandem Repeats Finder程序預測A+T富集區的串聯重復序列（Tandem repeats）[21]。

2 褐邊綠刺蛾和黃刺蛾線粒體基因組的比較

2.1 線粒體基因組的結構特點

大多數真核生物細胞線粒體基因組大小一般為15～20 kb[22]，而鱗翅目線粒體基因組大小一般在15～16 kb之間，由37個基因組成的共價閉合環狀雙鏈DNA分子，結構較為簡單，包括13個蛋白質編碼基因（PCGs）、22個轉運RNA基因（tRNA）以及2個核糖體RNA基因（rRNA） （12S rRNA和16S rRNA）。除此之外，還含有一段非編碼區（CR）[23]。

目前，已測定的褐邊綠刺蛾和黃刺蛾的線粒體基因組大小分別為15 296 bp和15 396 bp，兩者的基因組成均符合鱗翅目基因結構的特點。同時，在37個線粒體基因中，均為23個基因由J鏈（The majority strand）編碼，14個基因由N鏈（The opposite strand）編碼[24]。

2.2 PCGs基因

PCGs是控制蛋白質合成的基因，鱗翅目昆蟲的PCGs通常編碼4類蛋白質亞基：1個細胞色素b（Cyt b）基因、3個細胞色素氧化酶亞基基因（COⅠ、COⅡ和COⅢ）、7個NADH脫氫酶亞基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5和ND6）和2個ATP酶的亞基基因（ATP6、ATP8）。黃刺蛾的PCGs區密碼子總數為3 716個，其中，CUC、GUC、CCG、UGG、CGG和AGG不表達；最常見的氨基酸為亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，13個PCGs的AT含量為78.7%，AT偏向略正，GC偏向略負。大多數鱗翅目的PCGs都以ATN為標準的起始密碼子，僅個別種的COⅠ起始密碼子不固定或以四聯體密碼子（ATAA、ATTA、TTAG、GTAA、TTAA）和六聯體密碼子（TTTTAG、TATTAG、ATTTAA、ATTACG、TATCTA、TAGCGA）作為起始密碼子。褐邊綠刺蛾和黃刺蛾線粒體基因組中除了cox1基因以CGA作為起始密碼子，其余12個PCGs均以標準的ATN作為起始密碼子，并且以CGA為cox1的起始密碼子在其他節肢動物線粒體基因中也很常見。鱗翅目的PCGs終止密碼子一般為TAA或TAG，也有一些物種以不完整的密碼子T或TA為終止密碼子[25]，但不完整終止密碼子轉錄后經多聚苷酸化加工補全可形成完整的終止密碼子[26]。黃刺蛾的線粒體編碼基因中有7個PCGs以標準的TAA為終止密碼子，此外，nad4L基因以A為終止密碼子，cox1、cox2、nad2、nad4和cob基因以不完整的密碼子T作為終止密碼子。

2.3 tRNA基因和rRNA基因特征

tRNA是負責攜帶特定的氨基酸并將其轉運至氨基酸多肽鏈上的RNA，其能夠識別特定的密碼子。鱗翅目線粒體基因組中，tRNA基因一般為22個，其中14個tRNA基因是在J鏈被編碼的，其余8個均在N鏈被編碼，長度通常為60～75 bp。大多數后生動物中，除tRNA Ser（AGN）基因形成二級結構時缺少二氫尿嘧啶臂（D臂）無法形成典型的完整三葉草結構，其余所有tRNA均可形成典型的完整三葉草結構[27]。在褐邊綠刺蛾和黃刺蛾的線粒體基因組中，tRNA的特點與大多數鱗翅目昆蟲相符合。黃刺蛾線粒體基因組的22個tRNA長度為1 513 bp，每個tRNA大小在63～73 bp之間，其中A+T含量為82.4%，tRNA的AT偏向略正，GC略負。

rRNA是核糖體的組成部分，是細胞內含量最多的一種RNA，它可將氨基酸合成肽鏈，與蛋白質的合成有關，是較為重要的RNA。大多真核生物的rRNA為18S rRNA，而鱗翅目的rRNA則為12S rRNA（rrnS）和16S rRNA（rrnL）。在線粒體基因組中，rRNA是進化速度最慢，并且二級結構核心區域具有高度保守性的基因[28]。rRNA基因堿基的組成中含有大量的A+T，在多數種中，其A+T的含量多于PCGs中A+T的含量。黃刺蛾線粒體基因組中在trnL1（CUN）和trnV之間或trnV和A+T富集區之間存在2個rRNA基因（rrnS和rrnL），二者的大小分別為1 359 bp和793 bp，A+T含量為84.5%，AT偏向略正，GC略負。

2.4 非編碼區和基因重疊區

非編碼區指不能轉錄出對應信使RNA（mRNA）的核苷酸序列，即其不能指導蛋白質的合成，含有參與轉錄、復制的調控元件。鱗翅目的線粒體基因組非編碼區包括控制區和基因間隔區。

控制區的A+T堿基含量較高，因此，控制區又被稱為A+T富集區或D-loop區。它是動物線粒體基因組的復制起始區，也是線粒體中最大的調控、復制、轉錄且不編碼蛋白的核酸序

列[29]。鱗翅目昆蟲線粒體基因組的控制區主要包含5個元素：5′-端的poly T結構、輕鏈復制起點、類似微衛星的重復序列、高度變異區、靠近tRNAMet上游的一段poly A或poly T結構[30]。在大多數鱗翅目昆蟲線粒體基因組中，還存在著一段保守的特征序列：ATTTA，它位于控制區中間部分類似微衛星的重復序列前[31]。不同物種的控制區長度不同，控制區的長度取決于線粒體基因組總的長度大小。褐邊綠刺蛾的控制區長度為373 bp，黃刺蛾的控制區長度為401 bp，二者控制區均位于rrnS和trnM基因之間，在它們的控制區中發現，幾個保守結構中包括1個“ATAGA”序列，并且包含rrnS基因下游的1個poly T延伸和trnM基因上游的poly A延伸。此外，在黃刺蛾的控制區還發現了微衛星（AT）10元素位于富含A+T的區域，并且發現了3個串聯重復序列。黃刺蛾A+T富集區A+T堿基含量最高為93.3%，AT偏向和GC偏向均為微負。

在A+T富集區還存在著基因間隔區，它是編碼基因之間存在的非編碼區域，數目不等、長短不定[32]，據研究了解，線粒體基因組大小進化朝著減少的趨勢發展，它的實現是基于對基因間隔區的消除或削減[33]?；蜷g隔區包含5個元素：ployT、[TA（A） ]n-like結構、莖環結構、莖環結構5′的ATA與3′的G（A）n結構以及下游GT富集區[34]。黃刺蛾線粒體基因組中包含167 bp的基因間隔序列，分布在17個區域，大小從1 ～50 bp不等，最長的間隔序列為50 bp位于trnQ和nad2基因之間，富含A+T。

基因重疊區是指同一段核酸序列可以轉錄得到多個mRNA編碼不同蛋白質的基因區域。在鱗翅目線粒體基因組中也存在著長度較小、數目不等的基因重疊區域，一般僅由幾個堿基對組成，如位于atp6和atp8之間7 bp的“ATGATAA”序列和位于trnW和trnC之間8 bp的“AAGCCTTA”序列。在黃刺蛾線粒體基因組中有6個位置的基因之間有29 bp重疊，其中最長的為位于trnW和trnC之間的9 bp重疊。

2.5 基因重排

基因重排指DNA的核酸序列發生重排的現象?；蛑嘏趴煞譃橐孜?、倒置或原位倒置、基因重排、異位倒置4類?；蛑嘏趴梢宰鳛橄到y分析標記，也是昆蟲進化角度分析所用的第二個重要數據。此外，基因重排的程度能夠說明1個物種分子進化速率的快慢，基因重排越明顯，分子進化速率越快[35]。鱗翅目昆蟲線粒體基因中tRNA基因的排列始終處于保守狀態，僅有部分基因簇（trnM-trnl-trnQ）存在2種類型的排列方式（MIQ和IQM）[36]。IQM的復制可能導致IQMIQM的重排，第一次復制中IQ和第二次復制中M的隨機丟失可能產生了MIQ。這種重排可以通過串聯復制隨機損失（The tandem duplication-random loss，TDRL）模型解釋[37]，AR的易位可能是通過復制RA塊實現的，從而導致RARA排列。后續第一次復制過程中丟失A，第二次復制過程中丟失R，導致AR被RA替換。

褐邊綠刺蛾線粒體基因組中具有易位的基因重排現象，其重排方式為MIQ和一種導致“RANSEF”重排的獨特重排方式。這2種重排方式均可以用TDRL模型進行解釋。這種導致“RANSEF”重排的獨特重排方式是在褐邊綠刺蛾中發現的一種新重排方式。

據報道，在Astrotischeria sp.（Tisch-eriidae in Tischerioidea）線粒體基因組中有1個RNSAEF重排[38]，這種重排與褐邊綠刺蛾的RANSEF相似，都涉及trnR和trnA區域，與鱗翅目其他昆蟲形成對比。

3 討論與展望

目前，褐邊綠刺蛾線粒體基因組特點與大多數鱗翅目昆蟲基本相同，但未對褐邊綠刺蛾線粒體基因組中tRNA二級結構是否存在堿基錯誤配對現象、rRNA的位置大小、PCGs區域的終止密碼子、A+T富集區是否存在串聯重復序列、是否有基因間隔以及基因重疊區等方面進行分析。由此可知，褐邊綠刺蛾的線粒體基因組序列還需更加充分、完整的分析。綠刺蛾屬世界已知253種，我國已記載有46種，已報道的果樹害蟲有8種，但目前僅有褐邊綠刺蛾線粒體全基因組得到了測序與分析，并且褐邊綠刺蛾中線粒體基因組中發現了1種獨特的基因重排。因此，綠刺蛾屬中還需測定更多物種的線粒體基因組并分析其線粒體全基因組特點是否與褐邊綠刺蛾一致。

黃刺蛾屬世界已知7種，我國已記載有4種，但目前僅有黃刺蛾線粒體全基因組被測定。被測定的黃刺蛾線粒體基因組符合大多數鱗翅目昆蟲的特點，但黃刺蛾線粒體基因組中是否存在基因重排現象，以及tRNA二級結構是否存在堿基錯誤配對現象仍有待進一步分析。

目前，線粒體基因組測序技術發展迅速，但對綠刺蛾屬和黃刺蛾屬線粒體基因組的研究不夠深入。針對線粒體全基因組的研究不僅對刺蛾科昆蟲的系統進化和物種起源的準確分析有至關重要的作用，還對刺蛾科昆蟲害蟲的快速鑒定、防治起著重要的指導意義，為保護植被、提高果樹產量提供理論基礎。

參考文獻

[1] Solovyev A V， Saldaitis A. A new species of the genus Parasa Moore （Lepidoptera： Limacodidae） from Yemen[J]. Journal of Insect Science， 2010， 10（1）： 19001.doi.org/10.1673/031.010.19001.

[2] Wu S P， Chang W C. Review of the Parasa undulata （Cai， 1983） species group with the first conifer-feeding larva for Limacodidae and descriptions of two new species from China and Taiwan （Lepidoptera， Limacodidae）[J]. ZooKeys.

[3] 武春生，方承萊.中國綠刺蛾屬的新種和新紀錄種（鱗翅目，刺蛾科）[J].動物分類學報，2009，34（4）：917-921.

[4] Pan Z H， Zhu C D， Wu C S. A review of the genus Monema Walker in China （Lepidoptera， Limacodidae）[J]. ZooKeys， 2013， 306： 23-36.

[5] 桂炳中，王裊，趙國晨.中國綠刺蛾的為害和綜合防治方法[J].科學種養，2018 （2）：41.

[6] 陳文玉.泉州地區麗綠刺蛾的生物學特性及其綜合防治措施[J].湖北植保， 2022（5）：64–66.

[7] 王迪軒，張有民，郭賽，等.褐邊綠刺蛾對果樹的危害及其綜合防治[J].果農之友，2019（12）：19，42.

[8] 周榮軍，許興麗，薛玉燕.雙齒綠刺蛾生物學特性及防治方法[J].中國園藝文摘，2016，32（3）：105–106.

[9] 劉衛平，廖思平，廖文勝.兩色綠刺蛾觀察及防治試驗[J].林業科技情報，2014， 46（3）：16-17，20.

[10] 鄧艷，常明山，吳耀軍，等.跡斑綠刺蛾選擇性取食與紅樹科植物葉片內含物的關系[J].林業科技開發，2013，27（1）： 43–45.

[11] 楊政海.水稻綠刺蛾生活史和習性的初步研究[J].昆蟲知識，1986（2）：56-57， 97.

[12] 劉聯仁.漫綠刺蛾生物學觀察[J].昆蟲知識，1984（6）：255-257.

[13] 馮曉一，張澤勇，李娜，等.黃刺蛾發生規律和防治技術[J]. 現代農村科技， 2018（11）：24.

[14] Sun Y， Zhang X J， Liu S S， et al. The complete mitochondrial genome of the Parasa tessellata （Lepidoptera： Limacodidae）[J]. Mitochondrial DNA Part B， 2019， 4（1）： 1690-1691.

[15] Liu Q N， Bian D D， Jiang S H， et al. Characterization of the complete mitochondrial genome of the Oriental armyworm， Mythimna separata （Lepidoptera： Noctuidae）[J]. European Journal of Entomology， 112（3）， 2015， 112（3）： 399-408.

[16] Liu Q N， Chai X Y， Bian D D， et al. The complete mitochondrial genome of fall armyworm Spodoptera frugiperda （Lepidoptera：Noctuidae）[J]. Genes & Genomics， 2016， 38（2）： 205-216.

[17] Lowe T M， Eddy S R. tRNAscan-SE： A program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（5）： 955-964.

[18] Thompson J D， Gibson T J， Plewniak F， et al. The CLUSTAL_X windows interface： Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4876-4882.

[19] Benson G. Tandem repeats finder： a program to analyze DNA sequences[J]. Nucleic Acids Research， 1999， 27（2）： 573-580.

[20] Wolstenholme D R. Animal Mitochondrial DNA： Structure and Evolution[J]. International Review of Cytology， 1992，141： 173-216.

[21] Boore J L.Animal mitochondrial genomes[J]. Nucleic Acids Research， 1999， 27（8）： 1767-1780.

[22] Liu Q N， Xin Z Z， Zhu X Y， et al. A transfer RNA gene rearrangement in the lepidopteran mitochondrial genome[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2017， 489（2）： 149-154.

[23] Hu J， Zhang D X， Hao J S， et al. The complete mitochondrial genome of the yellow coaster， Acraea issoria （Lepidoptera： Nymphalidae： Heliconiinae： Acraeini）： sequence， gene organization and a unique tRNA translocation event[J].Molecular Biology Reports， 2010， 37（7）： 3431-3438.

[24] Coates B S， Sumerford D V， Hellmich R L， et al. Partial mitochondrial genome sequences of Ostrinia nubilalis and Ostrinia furnicalis[J].International Journal of Biological Sciences， 2005， 1（1）： 13-18.

[25] 何海燕，俞偉東，蔣韋斌.蝶類線粒體基因組學研究進展[J].生命科學，2016， 28（9）：978-985.

[26] Cao Y Q， Ma C， Chen J Y， et al. The complete mitochondrial genomes of two ghost moths， Thitarodes renzhiensis and Thitarodes yunnanensis： The ancestral gene arrangement in Lepidoptera[J]. BMC genomics， 2012（13）： 276.

[27] Sun E T， Li C P， Nie L W， et al. The complete mitochondrial genome of the brown leg mite， Aleuroglyphus ovatus （Acari： Sarcoptiformes）： Evaluation of largest non-coding region and unique tRNAs[J]. Experimental and Applied Acarology， 2014， 64（2）： 141-157.

[28] Masta S E. Mitochondrial sequence evolution in spiders： Intraspecific Variation in tRNAs Lacking the TPsiC Arm[J]. Molecular Biology and Evolution， 2000， 17（7）： 1091-1100.

[29] Gillespie J J， Johnston J S， Cannone J J， et al. Characteristics of the nuclear （18S，

5.8S， 28S and 5S） and mitochondrial （12S and 16S） rRNA genes of Apis mellifera （Insecta： Hymenoptera）： structure， organization， and retrotransposable elements[J].Insect Molecular Biology， 2006， 15（5）： 657-686.

[30] Taanman J W. The mitochondrial genome： Structure， transcription， translation and replication[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Bioenergetics， 1999， 1410（2）： 103-123.

[31] Kim M I， Baek J Y， Kim M J， et al. Complete nucleotide sequence and organization of the mitogenome of the red-spotted apollo butterfly， Parnassius bremeri （Lepidoptera： Papilionidae） and comparison with other lepidopteran insects[J]. Molecules and Cells， 2009， 28（4）： 347-363.

[32] 楊慧娟，董文鴿.纖恙螨屬線粒體基因組研究進展[J].中國人獸共患病學報， 2022，38（7）：649-656.

[33] Moritz C， Dowling T E， Brown W M. Evolution of animal mitochondrial DNA： Relevance for population biology and systematics.

[34] 張惠仙.2種鱗翅目昆蟲線粒體基因組的測序與分析[D].金華：浙江師范大學，2015.

[35] Xu W， Jameson D， Tang B， et al. The relationship between the rate?of molecular evolution and the rate of?genome rearrangement in animal?mitochondrial genomes[J]. Journal of?Molecular Evolution， 2006， 63（3）： 375-392.

[36] 陳魯.鱗翅目昆蟲線粒體基因組的結構特征分析[D].長沙：湖南農業大學， 2021.

[37] Cameron S L. Insect mitochondrial genomics： Implications for evolution and phylogeny[J].Annual Review of Entomology， 2014， 59（1）： 95-117.

[38] Timmermans M J T N， Lees D C， Simonsen T J. Towards a mitogenomic phylogeny of Lepidoptera[J].Molecular Phylogenetics and Evolution， 2014（79）： 169–178.

Advances in Mitochondrial Genome Studies of Parasa and Cnidocampa （Lepidoptera Limacodidae）

Yan Jiu-yang et al（College of Life and Geographic Sciences， Kashi University， Kashi， Xinjiang 844006）

Abstract Eucleid caterpillar which belongs to Lepidoptera， limacodidae， Parasa and Cnidocampa is commonly known as hot pepper. They often harm fruit trees， greening trees， crops， etc. There were 9 kinds of harmful phenomena reported in China. The sequencing of mitochondrial genomes lays a foundation for the prevention and control of pests. This paper summarizes the methods of extraction and analysis of the mitochondrial genomes of the two moths， and summarizes the structural characteristics of their mitochondrial genomes， protein-coding genes， tRNA genes， rRNA genes， non-coding regions （control regions and gene interval regions）， gene overlap regions and gene rearrangement phenomena. At the same time， the progress of mitochondrial genome sequencing in the two genera is summarized， and the future sequencing work is also prospected.

Key words Parasa; Cnidocampa; Mitochondrial genome