基于CRISPR/Cas9技術創制耐鹽香稻

李景芳 溫舒越 趙利君 陳庭木 周振玲 孫志廣 劉艷 陳海元 張云輝 遲銘 邢運高 徐波 徐大勇 王寶祥,*

基于CRISPR/Cas9技術創制耐鹽香稻

李景芳1溫舒越2趙利君2陳庭木1周振玲1孫志廣1劉艷1陳海元3張云輝3遲銘1邢運高1徐波1徐大勇1王寶祥1,*

(1連云港市農業科學院, 江蘇 連云港 222000；2南京農業大學, 南京 210095；3江蘇省農業科學院 種質資源與生物技術研究所, 南京 210014；*通信聯系人，email：wbxrice@163.com)

【目的】為了促進耐鹽香稻育種，利用CRISPR/Cas9系統對粳稻品種連粳11的和基因進行編輯，以期快速獲得一批不含有轉基因成分且具有耐鹽性和香味的純合水稻材料?！痉椒ā扛鶕突蛐蛄兄芯庉嬑稽c的敲除效率設計靶位點，構建pH-Ubi-Cas9--敲除載體，利用農桿菌介導法轉入受體品種連粳11中。對轉基因后代進行潮霉素和Cas9標記PCR檢測以及靶基因測序，獲得無外源基因插入的-純合株系，并對后代種子性狀和苗期耐鹽性進行分析?！窘Y果】T2代成熟種子中2-AP含量較背景材料連粳11顯著增加，千粒重、粒長、粒寬無明顯變化；128 mmol/L氯化鈉處理14 d后株系21-30較連粳11苗高增加15.2%，苗鮮質量增加45.2%，苗干質量增加13.2%?！窘Y論】利用CRISPR/Cas9技術對和基因編輯獲得能穩定遺傳且無外源基因插入的耐鹽香稻材料，加快了水稻多性狀聚合的選育進程。

水稻; CRISPR/Cas9; 耐鹽; 香味;;

土壤鹽堿化是制約水稻生產的主要非生物脅迫因素之一。我國鹽堿地面積廣，綜合利用潛力巨大。培育能夠利用沿海灘涂資源的耐鹽水稻品種是增加土地利用率、提高水稻種植面積和產量的重要途徑。

近年來，水稻中大量耐鹽相關基因被報道，如[1][2][3][4]、[5]、[6]等水稻耐鹽正調控基因以及[7]、[8]、[9]、[10]等水稻耐鹽負調控基因。其中，編碼一個包含696個氨基酸的B型反應調節蛋白轉錄因子，參與細胞分裂素信號轉導等過程，它的功能缺失顯著提高了耐鹽性。Zhang等[11]通過CRISPR/Cas9技術靶向編輯基因顯著提高了水稻耐鹽性。研究者也通過RNAi[8, 12]、T-DNA插入[13]、基因編輯[14]等手段獲得一系列耐鹽水稻材料。

優質米已經成為我國水稻生產的發展方向，米飯的香味是影響食味品質的重要因素之一?？刂扑鞠阄兜膿]發性物質種類有很多，而絕大多數香米與普通大米2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量存在顯著差異，2-AP的含量也常被用來評價稻米是否具有香味的重要參考指標[15]。水稻香味調控基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，其突變使得BADH2蛋白功能喪失，導致γ-氨基丁醛積累，導致2-AP含量增加，使稻米具有香味[16-17]。目前已有很多報道通過TALEN[18]、CRISPR/Cas9[19]等技術對水稻基因進行定向修飾，使BADH2蛋白功能缺失，成功創制具有香味的水稻。

對現有水稻品種性狀進行改良或者研發出具有優異性狀的品種是許多研究者一直努力的方向，目前選育優質抗逆品種主要是通過雜交和回交改良等常規育種手段，品種選育周期長，CRISPR/Cas9技術作為應用最為廣泛的基因編輯技術，可以對內源基因組進行敲除、插入、堿基替換、點突變等修飾，快速改良品種關鍵性狀，克服基因連鎖效應帶來的障礙，獲得具有優良性狀的新品種，未來可能在水稻遺傳育種改良中發揮重要作用。

本研究利用CRISPR/Cas9技術對連粳11水稻品種的耐鹽和香味基因同時進行編輯，對轉基因分離后代進行鑒定，篩選既耐鹽又具有香味且不含有外源基因插入的純合株系，以期為商業化育種技術的創新和產業發展提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以連粳11為遺傳轉化受體，開展遺傳轉化試驗。

1.2 載體構建及轉基因研究

通過NCBI網站獲得（Os08g0424500）和（Os06g0183100）基因組序列，登錄CRISPR-GE網站（http://skl.scau.edu.cn/）設計、基因靶位點，前引物為靶點序列5’端加上GGCA堿基，后引物為靶序列反向互補后5’端加上AAAC堿基（表1），通過酶切、連接分別構建兩個靶點的sgRNA入門載體，進一步酶切、連接，將和基因靶標sgRNA連接形成一個入門載體并與pH-Ubi-Cas9載體連接構建水稻最終表達載體[20]。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因測序由南京擎科生物有限公司完成。測序驗證正確的質粒轉入到農桿菌EHA105菌株中，利用農桿菌介導的方法侵染連粳11愈傷組織，并通過愈傷組織的篩選和分化等步驟獲取轉基因植株。

1.3 PCR鑒定及分析

1.3.1 T0代植株轉基因鑒定

分蘗前期取連粳11和轉基因植株葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，用潮霉素標記進行PCR鑒定，挑選T0代轉基因陽性株系種植。

1.3.2 T1代植株轉基因鑒定

分蘗前期取葉片，提取DNA，用潮霉素引物和Cas9標記引物進行擴增，剔除含有外源片段的植株，將不含有載體片段的植株用含有靶位點的引物進行PCR擴增和產物測序，測序結果使用DSDecodeM網站（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）和BioXM軟件分析，選取、編輯成功且純合的株系后代用于香味和耐鹽性鑒定。

1.4 耐鹽性鑒定

連粳11和基因編輯T1代純合種子用75%酒精消毒，室溫下浸種2ｄ，催芽1 d至種子露白，將露白種子播到底部剪開的96孔PCR板中進行水培，2～3 d換一次水。待幼苗長至1葉１心時，換成IRRI營養液培養[21]，每2～3 d更換一次營養液。當幼苗長至兩葉一心時，用含128 mmol/L NaCl的IRRI營養液培養[11, 22]，以標準IRRI營養液作為對照，每2～3 d更換一次營養液，處理2周后，拍照，測定苗高、苗鮮質量、苗干質量，并進行耐鹽性評價。所有測定均進行3次生物學重復。耐鹽相關基因相對表達水平測定，以作為內參基因，數據采用2?法進行分析[23]。

1.5 基因編輯后代表型分析

將成熟的連粳11和基因編輯T2代種子置于烘箱中60℃下烘至恒重，考查千粒重，并對粒長、粒寬進行測定。稻米香味物質2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量采用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀測定[19]。

2 結果與分析

2.1 基因編輯載體的構建

基因包含15個外顯子，基因包含6個外顯子，利用CRISPR-GE在線設計和基因靶位點，選取兩個分別位于第6外顯子和第3外顯子上的靶位點，對和基因進行編輯（圖1-A）。

A―Badh2和OsRR22基因結構及靶位點位置信息，綠色堿基代表PAM序列；B―Badh2和OsRR22基因靶點CRISPR/Cas9載體構建；C―表達載體中靶位點測序結果。

Fig. 1.andtarget sites and CRISPR/Cas9vector construction.

水稻pH-Ubi-Cas9終轉化載體構建完成后（圖1-B），進行靶位點測序，載體測序結果表明設計靶點序列能夠完全比對（圖1-C），將測序驗證正確的質粒轉化到農桿菌中并開展后續轉基因實驗。

表1 本研究中使用的引物

2.2 Badh2-OsRR22的編輯及無標記后代的鑒定

將和基因編輯載體轉化到連粳11的愈傷組織中，通過遺傳轉化獲得T0代轉基因苗，利用潮霉素標記篩選陽性轉基因植株，并進行下一代繁殖。

分別提取T1代轉基因單株DNA，通過Cas9載體引物篩選無外源標記的株系（圖2），并對篩選到的無外源標記的株系進行靶位點突變信息檢測，共檢測到6種不同的純合雙突變植株，其中，基因有4種突變類型，分別為插入A、缺失TA、缺失AGTCCTATA和缺失TAT。插入A導致蛋白翻譯過程中第267I→N、268V→S、269V→G、270F→V位氨基酸的替換，進而導致蛋白翻譯提前終止；缺失TA導致第267I→S、268V→G位氨基酸的替換，進而導致蛋白翻譯提前終止；缺失AGTCCTATA，導致第265S、266P、267I位這3個氨基酸的缺失；缺失TAT導致第267I位氨基酸缺失?；蛴胁迦隩、插入G和34 bp缺失等3種突變類型，分別導致出現一段氨基酸的替換后終止翻譯（圖3）。

M―DNA標記；“+”―陽性對照；“?”―陰性對照；1～9為T1代部分植株。Cas9標記目標片段大小為906 bp。

Fig. 2. Identification of Cas9 markers in some T1plants.

紅色箭頭表示突變位置?！?”代表插入；“-”代表缺失。黑色箭頭表示氨基酸位置。

Fig. 3. Mutation types at theandloci of the homozygous lines in T1

數據用平均數±標準差表示。*和**分別表示在5%和1%水平上差異顯著(t檢驗)。

Fig. 4. Salt tolerance identification of T2homozygous lines 21-30, 21-31 at the seedling stage.

2.3 基因編輯水稻耐鹽性鑒定

為了對基因編輯后代進行耐鹽性鑒定，我們挑選了T2代兩個純合株系21-30、21-31進行溫室苗期耐鹽性鑒定。分別使用水稻營養液和含有128 mmol/L氯化鈉的營養液處理，數據分析表明鹽處理條件下21-30和21-31株系苗高、苗鮮質量和苗干質量均顯著高于連粳11。21-30苗高較連粳11增加15.2%，苗鮮質量增加45.2%，苗干質量增加13.2%（圖4）。因此，與連粳11相比，基因編輯后代的耐鹽性增強。

對水稻耐鹽相關基因、、、、的相對表達量進行分析，定量結果顯示與連粳11相比，5個耐鹽調控基因均上調表達，其中、和在基因編輯后代中表達量顯著升高（圖5），表明基因編輯引起了耐鹽相關基因表達的改變。

數值用平均數±標準差表示。*表示在5%水平上差異顯著(t檢驗)。

Fig. 5. Relative expression levels of salt resistance related genes in the wild-type and its T2line 21-30.

2.4 T2代植株農藝性狀和2-AP含量測定

將野生型連粳11與T2代21-30、21-31株系成熟種子進行比較，與野生型相比，21-30、21-31后代千粒重、粒長、粒寬均無明顯差異。利用GC-MS對連粳11、21-30和21-31株系種子中2-AP物質含量進行測定，發現21-30和21-31種子中2-AP含量分別為0.277 mg/kg、0.294 mg/kg，而在連粳11種子中未檢測到2-AP（圖6）。

數值用平均數±標準差表示。**表示在1%水平上差異顯著 (t檢驗)。

Fig. 6. Performance of rice yield and fragrance related traits in the wild-type and its positive transgenic lines.

3 討論

連云港屬于沿海城市，大面積沿海灘涂地不適合種植水稻等農作物，目前選育的適宜該地區種植的耐鹽水稻品種相對匱乏，選育高耐鹽水稻品種可以增加土地利用率，提高水稻種植面積和產量。香味是一種特色的水稻品質，也是稻米重要的品質指標。選育耐逆的優質稻米品種是近年來育種的主要目標，雜交育種技術是水稻傳統育種的主要方法。與傳統育種方法相比，基因編輯技術具有編輯效率高、不攜帶外源基因等優點，CRISPR/Cas9基因編輯技術的出現使基因定向修飾更為簡便，是水稻種質改良技術中的重大突破，加快了水稻育種進程。本研究針對連云港地區水稻品種種植需求，利用基因編輯技術以耐鹽負調控基因和香味調控基因為靶標基因，構建雙基因串聯的CRISPR/Cas9基因敲除載體，轉入到連粳11愈傷組織中，對兩個基因同時進行編輯，通過轉基因后代鑒定，獲得無外源標記且穩定遺傳的耐鹽香味水稻株系。

利用基因編輯技術改良水稻的報道已有很多，如抽穗期、抗稻瘟病、香味、直鏈淀粉含量、粒型等性狀的改良，但同時對耐鹽和香味基因進行編輯的報道較少。Xu等[24]利用堿基精準編輯技術對基因進行三個靶位點的編輯，獲得了直鏈淀粉含量為1.4%～11.9%的一系列水稻突變體，一方面為水稻品質改良育種創制了新資源，另一方面也為水稻品質精準育種和快速改良提供了新思路。Liu等[25]利用基因編輯技術對的上游開放閱讀框(uORF)進行編輯，可以使水稻實現不同程度延遲開花（4.6～11.2 d）的目的，對未來微效改變水稻開花性狀的研究提供重要依據。徐善斌等[26]以、和為靶基因，構建CRISPR/Cas9敲除載體，轉入到龍粳11中，獲得無T-DNA元件的純合長粒香型水稻。

和分別為水稻耐鹽性和香味的負調控基因。本研究構建了和的雙基因敲除載體，利用農桿菌介導法轉到連粳11中，對這2個基因同時進行編輯，獲得了耐鹽香型水稻材料。通過對后代轉基因株系的篩選，獲得6個不含有外源基因的純合基因編輯株系，對其中21-30和21-31株系種子中2-AP含量測定結果表明香味物質含量增加至0.277和0.2294 mg/kg，苗期耐鹽性較連粳11顯著增強，且轉基因株系千粒重、粒長、粒寬等性狀無明顯差異，以上純合株系的獲得為耐鹽香型水稻的培育提供技術支撐和育種材料。

謝辭：北京大學瞿禮嘉教授課題組提供了本研究所用的CRISPR載體，在此深表謝意。

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Development of Aromatic Salt-tolerant Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology

LI Jingfang1, WEN Shuyue2, ZHAO Lijun2, CHEN Tingmu1, ZHOU Zhenling1, SUN Zhiguang1, LIU Yan1, CHEN Haiyuan3, ZHANG Yunhui3, CHI Ming1, XING Yungao1, XU Bo1, XU Dayong1, WANG Baoxiang1,*

(1Lianyungang Academy of Agricultural Science, Lianyungang 222000, China;2Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;3Institute of Germplasm Resources and Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, email: wbxrice@163.com)

【Objective】It is of importance to promotesalt-tolerant and fragrant rice breeding. We obtainedtransgene free homozygous rice materials with salt-tolerance and fragrance by CRISPR/Cas9-mediated editing ofandinvariety Lianjing 11. 【Method】Targetsites were designed according to knockout efficiency of editing sites inandgene sequence. The pH-Ubi--knockout vector was constructed and transferred into the recipient variety Lianjing 11 by the-mediated technology. PCR detection for hygromycin, Cas9 marker and target gene sequencing were performed in thetransgenic progenies to obtain-homozygous lines without exogenous gene insertion. The seed traits and salt tolerance at seedling stage were analyzed. 【Result】Compared with the background material Lianjing 11, the 2-AP content ofT2significantly increased. After treated with 128 mmol/L NaCl solution for 14 days, the seedling height, the fresh and the dry weight of T2line 21-30 increased by 15.2%,45.2% and 13.2%, respectively. 【Conclusion】The successfulediting ofandby CRISPR/Cas9 technology developed aromatic salt-tolerant homozygous lines without exogenous gene insertion, speeding up the breeding process of pyramiding multiple traitsin rice.

rice; CRISPR/Cas9; salt-tolerant; fragrance;;

10.16819/j.1001-7216.2023.220907

2022-09-28;

2022-12-19。

連云港市財政專項資金資助項目（QNJJ2102; QNJJ2211; QNJJ1803）；江蘇省農業重大品種創制計劃資助項目（PZCZ201704）；江蘇省政策引導類計劃（蘇北科技專項）資助項目（LYG-SZ202040）。