信號在冬小麥根系細胞中的產生及傳導機理

祁偉亮,孟建軍,張 成,劉自成,施萬喜,楊 虓,喬 巖,楊財容,喬義林,李金玲,陳思偉,姚來來,賴守孝,張 鵬,劉文輝,王 婧,袁蘭蘭

(1.隴東學院 農林科技學院,甘肅慶陽 745000;2.隴東旱地作物種質改良及產業化協同創新中心,甘肅慶陽 745000;3.甘肅省旱地冬小麥種質創新與應用工程研究中心,甘肅慶陽 745000; 4.成都師范學院 化學與生命科學學院,特色園藝生物資源開發與利用四川省高校重點實驗室,成都 611130)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料有品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’,源于隴東學院小麥研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 冬小麥遺傳背景分析 為進一步明確冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’的遺傳背景,染色體制片按照Qi等[14]的方法進行。首先將制備好的片子進行熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)分析,選用探針pSc119.2(綠色)和pTa535(紅色)檢測冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’的A、B、D染色體組。探針pSc119.2主要區分小麥B基因組,探針pTa535主要識別小麥A、B、D基因組[15]。探針pSc119.2和pTa535由上海英駿生物技術有限公司合成,雜交程序參照Fu等[16]和Qi等[14]的方法配置10 μL雜交液體系:pSc119.2(0.3 μL)+pTa535(0.3 μL)+9.4 μL(2 × SSC和 1×TE)緩沖液瞬時離心混合。每張載玻片上滴加10 μL探針工作液,置于37 ℃恒溫水浴鍋中雜交2 h,雜交完后用2×SSC溶液清洗,晾干后向每張載玻片上滴加10 μL DAPI復染液,黑暗環境下放置10 min后,然后用熒光顯微鏡(Olympus BX-51)采集照片。

1.2.2 ROS信號組織檢測 挑選籽粒飽滿的冬小麥種子,清洗干凈、吸干、低溫(4 ℃)春化12 h,以打破種子休眠。將冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’分別進行正常處理(25 ℃)、DPI+正常處理(25 ℃)、冷脅迫 (4 ℃)和DPI+冷脅迫(4 ℃)抑制處理。

正常處理(25 ℃)和DPI+正常處理(25 ℃):將冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’在正常處理(25 ℃)和 DPI+正常處理(25 ℃)條件下培養2 d,培養條件為晝夜溫度(25 ℃),光/暗周期(14 h/10 h),光照度(6 000 lx)。因DPI+正常處理(25 ℃)后種子未發芽,對正常處理(25 ℃)1 d和2 d的材料進行ROS組織染色,染色方法參照 Kumar等[17]的方法,首先將氯化硝基四氮唑藍(NBT)1%溶液倒入培養瓶,淹沒種子并避光侵染8 h。其后將材料浸泡在無水乙醇中。最后用甘油浸制并固定試驗材料并在正置熒光顯微鏡(BA410E)下拍照。DPI(317.92 μmol/L)稱取10 mg二苯基氯化碘鹽,以少許二甲亞砜溶解,用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)定容至100 mL。

冷脅迫(4 ℃)處理和DPI+冷脅迫(4 ℃)抑制處理:為了明確冷脅迫處理后,冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’在冷脅迫(4 ℃)環境下的發芽率、根系和芽的生長情況及ROS信號在冬小麥組織細胞中的產生規律。首先將冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’在冷脅迫 (4 ℃)條件下培養7 d,培養條件為晝夜溫度 (4 ℃),光/暗周期(14 h/10 h),光照度(6 000 lx)。然后分別對培養7 d的材料進行發芽率、根長和芽長測定,發芽率=種子發芽數/供試種子數×100%。

2 結果與分析

2.1 冬小麥遺傳背景及種子發芽情況分析

為進一步明確冬小麥品種‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’及品系‘隴育5-2’的遺傳背景,以pSc119.2和pTa535為探針進行遺傳背景分析,結果表明:‘隴育5號’(圖1-a)、‘隴育5-2’(圖1-b)、‘隴育8號’(圖1-c)和‘隴育10號’(圖1-d)等材料均屬于六倍體材料(2n=42),染色體組成為AABBDD基因組。

以pSc119.2(綠色)和pTa535(紅色)為探針對‘隴育5號’(a)、‘隴育5-2’(b)、‘隴育8號’(c)和‘隴育10號’(d)進行鑒定

在正常(25 ℃)環境下‘隴育5號’‘隴育5-2’‘隴育8號’和‘隴育10號’的發芽率無顯著差異(P>0.05)且發芽率均在95%以上,這說明供試材料的種子生長活力較好。在4 ℃冷脅迫環境下培養7 d后,‘隴育5號’‘隴育5-2’‘隴育8號’和‘隴育10號’種子的發芽率分別為91.71%、 90.63%、72.45%和62.78%(表1),且冷脅迫 (4 ℃)環境下品系‘隴育5-2’和‘隴育5號’的長勢顯著好于‘隴育8號’和‘隴育10號’(圖2),其中‘隴育5號’的芽長為2.15 cm,顯著長于品系‘隴育5-2’,但品系‘隴育5-2’的根長為3.81 cm,顯著長于‘隴育5號’(表1),這說明‘隴育5-2’和‘隴育5號’在冷脅迫環境下的適應能力存在差異性。

表1 冷(4 ℃)脅迫處理后冬小麥發芽率及生長情況

冬小麥‘隴育5號’(a)、‘隴育5-2’(b)、‘隴育8號’(c)和‘隴育10號’(d)

2.2 正常環境下在冬小麥組織細胞中的分布規律

冬小麥‘隴育5號’(a, b, c)、‘隴育5-2’(d, e, f)、‘隴育8號’(g, h, i)和‘隴育10號’(j, k, l)在正常環境下(25 ℃)培養1 d(a, d, g, j)和2 d(b, e, h, k)時,并采用NBT對冬小麥進行染色,藍色聚合物沉淀代表在植株體內的富集程度。在正常環境下 (25 ℃)DPI處理冬小麥‘隴育5號’(c)、品系‘隴育5-2’(f)、‘隴育8號’(i)和‘隴育10號’(l)2 d

2.2 冷脅迫環境下,在冬小麥組織細胞中的分布規律

對冷(4 ℃)脅迫處理(a, b, c, g, h, i)和冷(4 ℃)脅迫+DPI處理 (d, e, f, j, k, l)后的冬小麥幼苗進行NBT染色,‘隴育5號’(a, d, g, j)、‘隴育5-2’(b, e, h, k)、‘隴育8號’(c, f, i, l)

3 討 論

冬小麥是甘肅主要糧食作物,面積和產量均居全省口糧作物之首,其中旱地小麥約占 75%。而隴東作為甘肅冬小麥的主產區,因冬季嚴寒干旱、春季降水少,春旱和小麥生育后期高溫等環境因素影響,導致冬小麥的越冬率、產量及品質等造成嚴重影響。因此選育強抗寒抗旱冬小麥品種,是促進甘肅冬小麥增產的有效的技術途徑。目前在甘肅隴東等北部晚熟冬麥區生產推廣的‘隴育5號’[19]、‘隴育10號’[20]和‘隴育8號’[21]等品種具有較強的抗寒、抗旱性和豐產性,其中‘隴育5號’成為北部冬麥區旱地甘肅隴東和寧夏固原的第一大品種,2017年被全國農技中心確定為“華北、西北地區耐旱節水品種”。本研究通過FISH技術分析,結果表明‘隴育5號’‘隴育8號’‘隴育10號’和品系‘隴育5-2’等材料均屬于六倍體材料(2n=42)。在4 ℃冷脅迫環境下培養7 d后,‘隴育5-2’和‘隴育5號’的發芽率和長勢顯著好于‘隴育10號’‘隴育8號’,這說明‘隴育5-2’和‘隴育5號’在冷脅迫環境下具有較好的適應性。

3.2 NADPH酶介導產生的ROS在冬小麥細胞內及細胞間的信號傳導機制