棉酚對食管癌細胞系SEG-1細胞裸鼠模型體內作用的研究

陳 萍 劉 芳 艾惠如 張 利

青島大學附屬泰安市中心醫院1. 消化內科； 2. 門診部； 3. 急診科， 山東 泰安 271000

近幾年來，惡性腫瘤的發病率呈逐年升高趨勢，根據GLOBOCAN 2020 的估計，全球診斷出近2 億例新癌癥病例，而這些病例中近23.7%發生在中國［1］。我國是世界上最大的發展中國家，有著巨大的癌癥負擔。過去35年中，食管癌始終為我國常見的惡性腫瘤之一，其具有隱匿性、進展快、預后差及存在地區差異等特點，其發病率和死亡率一直居高不下［2-3］。因此，積極預防和治療食管癌對改善患者健康水平具有重要意義。近10來年，雖進行了大量的研究和實踐，但食管癌患者的生存率仍未有明顯的改善。因此越來越多的學者開始重視食管癌的發生、發展機制的研究，并據此尋找更為有效的靶點藥物，以提高食管癌患者的生存率。食管癌患者通常免疫功能低下，加之手術創傷等，致使術后患者早期一般不能耐受毒副作用大的化療藥物，從而使得體內的癌細胞迅速生長、擴散。由此可見，食管癌術后患者應使用毒副作用輕且有強抗腫瘤作用的藥物。目前，大多數研究集中于從自然界中尋找新的化學藥物。植物化學物為植物中天然存在的、含量較少的一類具有抗突變、抗癌或其它生理活性的化學物質。抑制增殖和誘導凋亡是化療藥物的主要作用機理，腫瘤細胞的耐藥性也是導致化療失敗的最主要原因，因此尋找具有強抗腫瘤活性，且能提高腫瘤對化療藥物敏感性的植物化學物是近期研究的熱點。

棉酚是由棉籽提取的化合物。自20世紀60年代開始研究者發現棉酚具有抗腫瘤作用。研究表明，棉酚可抑制肺癌、白血病、結腸癌、胰腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤、腎上腺皮質腫瘤等腫瘤細胞系細胞的增殖及誘導細胞凋亡，另外可增加耐藥腫瘤細胞對化療的敏感性［4］。有許多研究表明，棉酚具有較好的耐受性，對部分常規化療失敗的患者可提高療效，但其機制尚未明確。本團隊既往研究已證實，單醛棉酚與醋酸棉酚均對食管癌細胞系SEG-1 具有抗增殖、阻止細胞周期的作用［5］。本研究旨在探討棉酚在體內的抗癌作用，尋找食管癌防治的新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細胞系SEG-1，由鄭州大學消化疾病研究所提供。健康SPF 級BALb/c 雌性裸鼠30 只，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，體質量13 ～18 g。醋酸棉酚、單醛棉酚均由上海譜振生物科技有限公司提供。RPMI1640 培養基，美國Invitrogen公司。胎牛血清，天津懿陽生物制品有限公司。L-谷氨酰胺，北京天根生化科技有限公司。青霉素、鏈霉素，美國Amresco 公司。臺盼藍，美國Sigma 公司。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO），北京博大泰克公司。75%酒精，山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司。NaCl， KCl，分析純，南京化學試劑一廠。磷酸氫二鉀（K2HPO4），磷酸二氫鈉（NaH2PO4），成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 主要溶液制備 PBS 緩沖液：取KCl 0.2 g、NaCl 8.0 g、Na2PO43.49 g、K2HPO40.24 g，加入去離子水，攪拌至完全溶解，調節pH值 = 7.4后，定容至1 L，高壓滅菌，4 ℃保存備用；棉酚：在超凈工作臺上以無菌級DMSO 配成50 μmol/L 儲存液，-20 ℃冷凍保存，每周配制1 次。配好后在含血清的固體培養基中進行細菌培養72 h，無菌生長方可使用；RPMIl640培養基配制：稱取10.4 g RPMIl640粉末，加入3.7 g NaHCO3， 2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素，調整pH 到7.2，加蒸餾水定容至l L，0.22 μm 過濾除菌，加入經滅活處理（56 ℃，30 min）的10%的胎牛血清，4 ℃保存；棉酚配制：每次動物實驗前新鮮配制所有濃度的棉酚，以DMSO溶解后再溶于PBS中，DMSO終濃度為10%。

1.2.2 細胞培養 將食管癌細胞系SEG-1 放在含2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 U/mL鏈霉素、10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的RPMI l640 培養基中，放在5%CO2、37 ℃、飽和濕度下培養。0.25%的胰蛋白酶消化細胞傳代，每2 ～ 3天傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3 食管癌細胞系SEG-1 細胞動物模型建立取對數生長期的細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，收集消化液離心后除去上清液，加入培養液制成細胞濃度約為1 × 107/mL 懸液待種，用75%酒精消毒裸鼠局部皮膚后，用注射器抽取0.2 mL細胞懸液注射到每只裸鼠的左前肢腋窩皮下。裸鼠左前肢腋窩長出腫塊后，將腫塊解剖制成細胞懸液后進行Wright-Giemsa染色觀察腫瘤細胞的形態學。

1.2.4 裸鼠分組方法、給藥方法及觀察指標 裸鼠接種癌細胞72 h后，在小鼠腹腔內注射200 μL的醋酸棉酚或單醛棉酚溶液。將30只裸鼠分6組，分別為醋酸棉酚40 mg/kg組、醋酸棉酚60 mg/kg組、單醛棉酚40 mg/kg組、單醛棉酚60 mg/kg組、空白對照組、陰性對照組，各組5 只；醋酸棉酚40 mg/kg 組在接種后第4 天和第6 天注射醋酸棉酚溶液，每天注射劑量為20 mg/kg；醋酸棉酚60 mg/kg 組在接種后4、5、6 天注射醋酸棉酚溶液，每天注射劑量為20 mg/kg；單醛棉酚40 mg/kg組在接種后第4天和第6 天注射單醛棉酚溶液，每天注射劑量為20 mg/kg；單醛棉酚60 mg/kg組在接種后第4、5、6天注射單醛棉酚溶液，每天注射劑量為20 mg/kg?？瞻讓φ战M不接種腫瘤及不給藥、陰性對照組接種SEG-1細胞，腹腔注射含10%DMSO的PBS。每日觀察裸鼠的活動、皮膚變化，記錄給藥前及給藥后每天體質量、腫瘤大小，裸鼠死后則記錄其生存時間，死后12 h 內取肝、脾測肝、脾質量。

腫瘤生長變化：記錄給藥當天即0天，每隔1天用游標卡尺測量裸鼠腫瘤最大的長徑、寬徑、厚徑1次，三徑相互垂直，記錄體積變化。瘤體積計算方法：腫瘤體積（mm3） = 長徑 × 寬徑 × 厚徑 × π/6。腫瘤生長抑制率：［1-（陰性對照組腫瘤的平均體積在1 g左右時給藥各組的腫瘤平均質量/陰性對照組腫瘤的平均質量）］ × 100%。腫瘤生長延遲：給藥各組腫瘤重量達到0.7 g時的天數和陰性對照組達到相同質量的天數之差。

1.3 統計學處理

選用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據處理，符合正態分布數據用計量資料（xˉ ±s）描述，經方差齊性檢驗后，多組間比較用LSD 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α= 0.05。

2 結 果

2.1 食管癌SEG-1細胞裸鼠模型的建立

裸鼠在接種前生活狀態始終正常、食欲旺盛、行動自如。皮下接種1 × 107個SEG-1細胞后第1天即出現精神萎靡、飲食不振、體毛聳立等癥狀，繼而行動遲緩直至死亡。裸鼠在接種細胞第4天時皮下出現肉眼可見的明顯腫塊，腫塊逐漸增大，裸鼠存活時間為（13.0 ± 1.0）d。死亡后解剖發現腫瘤灶與周圍組織粘連，部分裸鼠腹腔有腹水，肝脾腫大。腫塊解剖后制作成細胞懸液，染色后于顯微鏡下觀察腫瘤細胞形態結構與SEG-1細胞一致。

2.2 病理學檢查

本研究選取醋酸棉酚40 mg/kg 組代表給藥組腫瘤與陰性對照組裸鼠的腫瘤標本進行病理對照。給藥組腫瘤大小及浸潤范圍均小于陰性對照組，腫瘤分化稍好于陰性對照組，腫瘤血管形成較陰性對照組差。

給藥組：與陰性對照組的腫瘤組織比較，腫瘤細胞分化較好，腫瘤間質組織較豐富，細胞形態較一致，細胞較大，胞漿豐富，病理性核分裂少。腫瘤血管形成差，可見部分細胞缺血性壞死。腫瘤浸潤范圍較小，尚未超過基底層（圖1）。

圖1 給藥組裸鼠皮下腫瘤的病理表現（HE染色， × 400）

2.3 棉酚在裸鼠體內的抗腫瘤活性

各給藥組裸鼠皮下腫塊均出現不同程度的縮小、腫塊生長速度減慢（圖2A）。腫瘤生長抑制率：醋酸棉酚40 mg/kg組、醋酸棉酚60 mg/kg組、單醛棉酚40 mg/kg組、單醛棉酚60 mg/kg組分別為14.3%、31.2%、33.7%、32.9%，醋酸棉酚40 mg/kg 組的生長抑制率明顯低于醋酸棉酚60 mg/kg 組、單醛棉酚40 mg/kg組、單醛棉酚60 mg/kg組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），醋酸棉酚40 mg/kg 組腫瘤生長延遲天數比醋酸棉酚60 mg/kg組、單醛棉酚40 mg/kg組、單醛棉酚60 mg/kg 組少1d，見表1。各組裸鼠接種后腫瘤質量、體積變化趨勢見圖2A和2B。

表1 各給藥組腫瘤生長抑制率和腫瘤生長延遲情況比較

圖2 不同劑量醋酸棉酚和單醛棉酚對接種SEG-1細胞的裸鼠腫瘤的影響

2.4 棉酚對接種腫瘤裸鼠肝、脾臟的影響

2.4.1 棉酚對接種腫瘤裸鼠肝的影響 在接種腫瘤后第10天、死亡時解剖裸鼠發現，未接受棉酚干預的陰性對照組裸鼠肝臟較正常裸鼠肝臟明顯增重，說明SEG-1腫瘤細胞已經發生肝轉移；給予40 mg/kg醋酸棉酚干預的接種裸鼠肝臟質量明顯低于陰性對照組；給予60 mg/kg 醋酸棉酚干預的裸鼠由于存活時間較短，肝臟質量未列入統計。給予40 mg/kg 或60 mg/kg單醛棉酚干預的裸鼠肝臟較對照組并沒有減輕，說明醋酸棉酚除了對腫瘤細胞產生毒性作用外，還對肝臟正常細胞產生毒性作用，而單醛棉酚不同劑量對裸鼠的肝臟并無明顯影響，見表2和圖3。

表2 不同濃度棉酚對接種裸鼠肝臟重量的影響

圖3 不同濃度兩種棉酚對接種腫瘤裸鼠生存期的影響（與對照組相比，*P ＜ 0.05）

2.4.2 棉酚對接種腫瘤裸鼠脾的影響 在接種腫瘤后第10 天、死亡時解剖裸鼠發現，未接受棉酚干預的陰性對照組裸鼠脾臟較正常裸鼠脾臟明顯增重，說明SEG-1 腫瘤細胞已經發生脾轉移。給予40 mg/kg醋酸棉酚干預的接種裸鼠脾臟質量明顯低于陰性對照組；給予60 mg/kg 醋酸棉酚干預的裸鼠由于存活時間較短，脾臟質量未列入統計。而給予40 mg/kg或60 mg/kg單醛棉酚干預的裸鼠脾臟腫瘤較陰性對照組雖有降低，但降低程度較小，說明醋酸棉酚除了對腫瘤細胞產生毒性作用外，還對脾臟正常細胞產生毒性作用，而單醛棉酚不同劑量對裸鼠的脾臟影響較小，見表3。

表3 不同濃度棉酚對接種裸鼠脾臟質量的影響

2.4.3 棉酚對接種腫瘤裸鼠生存期的影響 醋酸棉酚40 mg/kg 組裸鼠生存時間為8 ～ 13 d，平均（8.9 ±1.0）d；醋酸棉酚60 mg/kg組裸鼠生存時間為6 ～ 11 d，平均（8.2 ± 0.9）d；單醛棉酚40 mg/kg 組裸鼠生存時間為10 ～ 16 d，平均（12.9 ± 0.6）d；單醛棉酚60 mg/kg組裸鼠生存時間為10 ～ 15 d，平均（12.3 ± 0.8）d；陰性對照組裸鼠生存時間為10 ～ 18 d，平均（13.1 ±1.1）d。醋酸棉酚40 mg/kg組、醋酸棉酚60 mg/kg組裸鼠生存時間明顯短于陰性對照組；單醛棉酚40 mg/kg 組、單醛棉酚60 mg/kg 組裸鼠生存時間與陰性對照組比較，差異無統計學意義，見圖4。

圖4 各組的裸鼠接種腫瘤后體重隨時間的變化

2.4.4 棉酚對接種裸鼠體質量的影響 陰性對照組裸鼠接種SEG-1細胞后13 d后體質量顯著超過未接種SEG-1 細胞的裸鼠。醋酸棉酚40 mg/kg 組、醋酸棉酚60 mg/kg組裸鼠經腹腔注射醋酸棉酚后第1天開始出現活動減少，逐漸消瘦；醋酸棉酚60 mg/kg組裸鼠體質量在用藥第5天開始顯著低于陰性對照組，醋酸棉酚40 mg/kg 組裸鼠體質量在用藥第6 天開始顯著低于陰性對照組。單醛棉酚40 mg/kg 組、單醛棉酚60 mg/kg 組裸鼠經腹腔注射醋酸棉酚后體質量變化與陰性對照組基本一致（見圖4）。

3 討 論

食管癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，我國發病和死亡人數分別占全球的53.7%和55.3%［6］。據2019 年中國腫瘤登記年報結果顯示，我國2015食管癌發病24.6 萬，居惡性腫瘤第6 位；死亡18.8萬，居惡性腫瘤死亡第4位［7-8］。食管癌好發于男性人群，其在我國男性患者死亡率僅次于第1 位的胃癌，而在女性患者中僅次于宮頸癌居第3位，因此該病已成為威脅人們生命健康的重要疾病。手術治療、放射治療、化學藥物治療、內鏡治療和中醫藥治療等方法是食管癌目前常用的治療方法。然而，即便近年來已不斷改善，這些方法的療效仍不完全令人滿意，食管癌仍為預后較差的惡性腫瘤之一，我國食管癌患者總體5年生存率僅為29.7%［9］。因此選擇新的抗食管癌藥物，探索新的靶向治療，是目前食管癌治療的熱點問題。

化療是腫瘤治療領域中重要的治療手段，然而，傳統的化療藥物往往毒副作用較大，治療期間，腫瘤患者的正常器官組織也會受到不同程度的損害，故尋找無毒副作用或較輕毒副作用的藥物已成為腫瘤治療的新熱點。并且我國食管癌早期發現率低，確診時I期患者僅占17%［2］，化療在食管癌的治療中起著重要的作用。近年來，食管癌的化學防治多集中于丁酸甘油脂、維生素類、姜黃素、棉酚等藥物，其中棉酚具有抑制多種惡性腫瘤生長的作用，其部分衍生物由于毒副作用輕微而引起廣大學者的重視。

目前，有關棉酚的抗腫瘤作用主要通過體外實驗得以證實，而本實驗則將其作為新藥物進行體內研究加以證實該藥的抗腫瘤特性。研究發現，很多體外實驗研究證實的Bcl-2小分子抑制劑具有良好的抗腫瘤特性，但應用于臨床試驗時卻不能達到預期的療效，其原因是這些藥物在體外實驗所具有的抗腫瘤作用或細胞毒性作用在體內實驗時無法發揮。為此，本實驗在SEG-1 裸鼠模型中應用棉酚干預，以了解棉酚是否能在裸鼠體內發揮抗腫瘤的特性。實驗結果顯示，棉酚的2 種衍生物醋酸棉酚和單醛棉酚在食管癌細胞系SEG-1細胞裸鼠模型體內產生一定的抗腫瘤作用。不同濃度的醋酸棉酚、單醛棉酚均可減小腫塊，其中40 mg/kg 醋酸棉酚的腫瘤抑制率最低，為14.3%，腫瘤生長延遲2 天，而60 mg/kg 醋酸棉酚為31.2%，40 mg/kg、60 mg/kg 單醛棉酚的腫瘤抑制率分別為33.7%、32.9%，腫瘤生長延遲均為3 d。另外，實驗結果顯示，陰性對照組的肝脾均較正常增大，提示腫瘤已發生了肝脾轉移；給予醋酸棉酚治療后，裸鼠的肝脾均出現縮小，提示醋酸棉酚可有效地縮小腫大的肝脾，對轉移性腫瘤具有抑制作用。然而醋酸棉酚同時縮短了裸鼠的生存時間，表明它雖具有抗腫瘤的特性，但同樣對正常組織細胞產生毒性作用。單醛棉酚則不同，其對腫瘤組織具有抗增殖作用，同時對肝脾正常細胞毒性作用較小，從而延長了裸鼠的生存時間。

傳統的實驗證實，棉酚的治療范圍較窄。它在臨床應用中易出現以下毒副作用：①生殖毒性，棉酚具有殺精作用，早期作為男性避孕藥而應用于臨床，然而作為抗腫瘤藥物時，這種殺精作用則成為不良反應。②肝臟毒性，應用棉酚處理的小鼠肝臟病理可見充血性壞死，其機制可能與電子傳遞、氧化應激、自由基密切相關［10］。本實驗結果也證實了醋酸棉酚對肝臟具有一定的毒性作用。③心臟毒性，棉酚可引起實驗小鼠呼吸困難、頸靜脈怒張、心律失常等表現，棉酚具有阻止氧化血紅蛋白釋放氧的作用。④低鉀血癥，在棉酚的早期應用研究中，研究者們發現，低鉀血癥是棉酚的一個較嚴重的副作用，但近期研究表明，低鉀血癥并非完全是棉酚引起，而與地區差異、飲食習慣、營養不良等相關。

棉酚分子結構中存在2 個活性醛基，這是產生毒性的主要活性結構，通過阻斷醛基的作用是降低棉酚的毒性有效方法［11］。藥理研究表明，若同時阻斷棉酚分子結構中的2 個活性醛基，棉酚就會失去抗腫瘤活性，若保留1 個醛基則可使棉酚具有抗腫瘤作用的同時，毒性也明顯降低［12］。鑒于此，本實驗采用無活性醛基的醋酸棉酚和有1個活性醛基的的單醛棉酚做對照。本動物實驗發現，醋酸棉酚具有較大的毒性，而同劑量的單醛棉酚則無明顯毒副作用，故推測，單醛棉酚較醋酸棉酚更適用于臨床。本實驗觀察到裸鼠的生存期并未得到有效延長，腫瘤在短期抑制后即會迅速增長，提示棉酚在體內的作用尚待進一步提高。研究表明，血清中的蛋白與棉酚結合，從而降低棉酚的活性，使其抗腫瘤作用降低［13］。因此，尋找阻斷棉酚與體內血清蛋白結合的方法也是當前有關棉酚研究的一個熱點。潘奇等［13］研究表明，棉酚聯合其他化療藥物治療可增強化療的效果，如聯合CHOP 和棉酚治療淋巴瘤能獲得比單一CHOP 治療更好的效果，因此化療藥物聯合棉酚對食管癌的治療也是下一步研究的方向。

綜上所述，棉酚可抑制食管癌裸鼠模型的腫瘤生長，醋酸棉酚具有明顯的毒性作用，而單醛棉酚有較高的安全性，這為未來將棉酚應用于食管癌的臨床治療提供了實驗依據。