人參莖葉中人參皂甙含量檢測前處理工藝優化及方法學考察

楊景霞，劉凱華，毛華，張良明，楊陽

（西安天一生物技術股份有限公司，陜西西安 710000）

人參（Panax ginsengC.A.Mey.）為五加科植物的干燥根及根莖[1]?！渡褶r本草經》記述人參具有主補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目益智，久服輕身延年的功效[2]。人參的主要活性成分為人參皂甙，廣泛分布于人參各個部位[3]。迄今為止，人們已從人參中分離鑒定出40 余種人參皂苷單體，人參皂苷屬于三萜類皂苷[4]。人參莖葉為人參的地上部分，為了充分利用人參資源，人們對人參的研究已拓展到莖葉部分。研究表明，人參莖葉皂苷不僅具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、保肝護心、提高免疫、促進細胞增殖等功效，在緩解疲勞方面也起到一定的作用[4-6]。

人參莖葉原料質量來源不一，對原料的驗收標準較為模糊。一方面藥典中原料的檢測方法主要針對人參葉中人參皂甙Rg1 與人參皂甙Re，原料的前處理比較復雜，用時較長；但人參莖中也含有人參皂甙，在大生產中，會對莖和葉整柱利用，而不會僅利用葉子。另一方面由于采用藥典中檢測人參葉的方法對人參莖葉中皂甙含量進行檢測的結果偏低，一般Rg1+Re 含量不超過1.2%，與生產的最終產品轉移率不對應。因此，認為采用藥典中檢測人參葉中皂甙含量的方法不適用于人參莖葉整柱的檢測。

結合藥典中人參莖葉提取物及市場對人參莖葉提取物的活性成分要求（Rg1、Re、Rd 的總量應為30%～45%），本研究以這3 種活性成分總和為標準，采用正交實驗進行原料前處理條件的優化，確定人參莖葉原料的檢測方法并研究其方法的可靠性、準確性，為人參莖葉原料中人參皂苷的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Agilent 1100 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；SQP 十萬分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；KQ-600DV 臺式數控超聲波清洗器，昆山市禾創超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料

人參莖葉，采摘自吉林省白山市撫松縣，經西安天一生物技術有限公司質量部顯微鑒定為五加科植物人參的干燥葉。人參皂甙Rg1 對照品（110703—202034）、人參皂甙Re 對照品（110754—202129）、人參皂甙Rd 對照品（111818—202104），中國食品藥品檢定研究院；甲醇，色譜純，德國MERCK公司；乙腈，色譜純，德國MERCK 公司；磷酸，分析純，天津科市恒興試劑制造有限公司；甲醇，分析純，天津科密歐公司；氧化鎂，分析純，福晨天津化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液制備

（1）混合對照品溶液的制備：精密稱定人參皂苷Rg1（94%）對照品16.02 mg、人參皂苷Re（96%）對照品24.37 mg 和人參皂苷Rd（97.3%）對照品10.33 mg，加甲醇溶解后，定容于50 mL 的容量瓶，制成混合對照品溶液。

（2）供試品溶液制備：取5 g 粉碎后過40 目篩的人參莖葉原料置250 mL三角瓶中，加0.10 g氧化鎂，再加入約200 mL 自來水，60 ℃超聲提取1.5 h，提取結束后放涼，提取液過濾至250 mL 容量瓶中。提取渣用水洗，定容至250 mL 容量瓶，搖勻，即得。

1.3.2 色譜條件與系統適用性條件

色譜柱：Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫（0 ～30 min，流動相A 19%，流動相B 81%；30 ～35 min，流動相A 19%—24%，流動相B 81%—76%；35 ～60 min，流動相A 24%—40%，流動相B 76%—60%）；柱溫30 ℃；流速1.3 mL/min；檢測波長203 nm；理論塔板數按人參皂甙Rg1 峰計算應不低于6 000[1]。此條件下人參莖葉供試品中各組分峰形較好，共存成分不干擾人參皂甙的檢測，所得高效液相色譜圖見圖1。

圖1 標準品與樣品色譜圖

1.3.3 人參總皂甙含量的測定

在1.3.2 色譜條件下，待儀器穩定基線平穩后，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定。用外標法計算樣品中人參總皂甙的含量。

1.4 方法學考察

1.4.1 人參莖葉原料前處理條件優化實驗

在前期單因素實驗的基礎上，以氧化鎂加入量、原料粉碎粒度、提取溫度、超聲時間為考察因素，每個因素各取3 個水平，以人參總皂甙為考察指標，設計正交實驗因素水平表，見表1。

表1 因素水平表

1.4.2 人參莖葉原料中總皂甙最佳提取工藝驗證實驗

根據正交實驗確定的最佳提取工藝，進行三批次驗證，通過1.3.2 項下方法測定人參總皂甙含量，以確保該條件為最佳提取工藝。

1.4.3 線性關系考察

精密吸取1.3.1 項下人參皂甙混合對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 和30 μL，注入高效液相色譜儀，按1.3.2 項下色譜條件測定，以進樣量為橫坐標，人參總皂甙含量為縱坐標，進行線性回歸。

1.4.4精密度試驗

取1.3.1 項下配制的供試品溶液10 μL，按1.3.2項色譜條件連續進樣6 次，分別記錄人參皂甙Rg1、Re、Rd 的峰面積，計算人參皂甙總含量。

1.4.5重復性實驗

取同產地同一批人參莖葉樣品粉末約5 g，按1.3.1 項方法制備6 份供試品溶液，按1.3.2 項色譜條件測定人參總皂甙的含量，記錄數據。

1.4.6穩定性實驗

精密吸取1.3.1 項配制的人參莖葉樣品供試品溶液，按1.3.2 項色譜條件測定人參總皂甙的含量，每間隔2 h 進樣一次，每次10 μL，重復6 次，記錄12 h 內人參總皂甙的含量。

1.4.7加樣回收實驗

取9 份已知含量的人參莖葉粉末（批號Y220101）約5.0 g，精密稱定后置于圓底燒瓶，分別加入1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 的對照品溶液，按1.3.1 項制備供試品溶液，再按1.3.2 項色譜條件測定人參總皂甙含量，計算加樣回收率。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果

正交實驗結果及方差分析見表2、表3。通過分析正交實驗結果，得出各因素對人參莖葉總皂甙含量影響的主次順序為A＞B＞C＞D，即氧化鎂的加入量＞原料粉碎粒度＞提取溫度＞超聲時間，分析K值得出的最佳條件為A2B2C2D2，即氧化鎂加入量為0.10 g，原料過40 目篩，提取溫度為60 ℃，超聲提取時間為1.5 h。

表2 正交實驗結果

表3 人參莖葉總皂甙正交實驗方差分析

2.2 人參莖葉總皂甙最佳提取工藝驗證

為了驗證得出的最優組合的可靠性、準確性，同時排除偶然性，本實驗按照A2B2C2D2組合，在氧化鎂加入量為0.10 g，原料過40 目篩，60 ℃下超聲提取1.5 h 的條件下進行驗證實驗，平行3 次。實驗得出，該條件下人參莖葉原料中總皂甙含量平均值為3.93%，優于正交表中第5 組結果。因此確定最佳原料前處理工藝為氧化鎂加入量0.10 g，原料過40目篩，溫度60 ℃，超聲提取時間1.5 h。

2.3 線性關系

以進樣量為橫坐標，人參總皂甙含量為縱坐標，線性回歸方程為Y=1.605 92X+18.629 33，r=0.999 6，表明方法線性關系良好。

2.4 精密度

按1.4.4 項方法得到人參總皂甙的含量分別為3.78%、3.81%、3.85%、3.79%、3.87% 和3.75%，RSD=1.18%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5 重復性

按1.4.5 項方法得到人參莖葉原料中人參總皂甙含量為3.85%、3.76%、3.79%、3.86%、3.81%和3.89%，RSD=1.27%（n=6），表示本方法重復性良好。

2.6 穩定性

按1.4.6 項方法每間隔2 h 進樣一次，得到人參莖葉原料中人參總皂甙含量為3.79%、3.85%、3.86%、3.80%、3.87%和3.75%，RSD=1.24%（n=6），實驗結果表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.7 加樣回收實驗結果

人參莖葉中人參總皂甙的加樣回收實驗結果見表4，人參總皂甙的平均加樣回收率為99.4%，RSD值為0.25%（n=9），表明本方法回收率良好。

表4 人參總皂甙回收率實驗結果（n=9）

3 討論與結論

本文以人參莖葉原料中總皂甙含量為考察指標，通過對氧化鎂的加入量、粉碎的粒度、提取溫度和超聲時間進行正交實驗，優化人參莖葉原料中總皂甙含量檢測的前處理工藝，確定人參莖葉原料的檢測方法并進行方法學考察。

人參莖葉原料前處理的最佳工藝為氧化鎂加入量0.10 g（即原料重量的2%），原料過40 目篩，提取溫度60 ℃，超聲提取時間1.5 h。其中氧化鎂的添加量對提取結果的影響最大，一方面由于氧化鎂可以吸附提取液中的葉綠素等雜質，消除了雜質對有效成分包裹影響含量檢測，另一方面氧化鎂為堿性，可以改變細胞壁的透過性，使有效成分能更好的溶出，同時也增大了其他雜質的溶出[7]。其次是原料粉碎粒度，當原料的顆粒較大時，相同質量的樣品在提取過程中與提取溶劑的接觸表面積較小，會使各物質無法被充分提??；當粉碎粒度過小，表面吸附作用加強，有效成分擴散速度受到影響，而且用水提取時黏液質等雜質會由于粉過細而產生膠凍現象，導致大量細胞破裂，溶質間更易形成糊狀，不僅影響有效成分的浸出，且不易過濾[8]。提取溫度對結果的影響具有雙重性，升高溫度可以降低液體黏度，減小傳遞阻力，同時可以促進分子熱運動，提高擴散系數，并增加溶質的溶解度，有利于有效成分提取，但溫度過高會使物質分解變性，最終導致總皂甙含量降低。為了使有效成分完全傳遞至提取液中需要一定的時間，達到一定時間后，傳遞趨于平衡，凈傳遞量不再增加，提取過程中可能會由于分解或其他雜質的溶解使提取率降低，另外提取時間過長會增加操作成本。

本研究中人參莖葉原料提取液不需要通過層析柱純化，而是優化原料前處理條件，將提取液中的人參皂甙萃取到目標體系，直接進行高效液相色譜檢測。通過正交實驗確定人參莖葉原料前處理的最佳工藝為氧化鎂加入量0.10 g（即原料重量的2%），原料過40目篩，提取溫度60 ℃，超聲提取時間1.5 h。通過方法學驗證，確定人參莖葉原料中人參皂甙含量的檢測方法可靠、準確，可為今后人參莖葉原料的檢測提供參考。