薄膜過濾法在抗生素類注射劑無菌檢查中常見問題及分析

簡秋瑜，袁海梅

（1.云南省食品藥品審核查驗中心，云南昆明 650000；2.楚雄州檢驗檢測認證院,云南楚雄 675000）

抗生素類注射劑在一定程度上可抑制微生物生長和繁殖，但在用常規方法對其進行無菌檢查時容易出現假陰性結果。按照2020 年版《中華人民共和國藥典》規定[1]，只要供試品性狀允許，包括能直接過濾或者經過處理后能過濾的供試品，應采用薄膜過濾法進行無菌檢查。選用薄膜過濾法檢測抗生素類注射劑，可將藥物抗微生物物質去除，細菌等其他微生物則會遺留在過濾器，對其培養促使生長和繁殖，以此定性或定量檢測微生物[2]。由于不同類別抗生素類注射劑的抗菌活性、抗菌譜不同，在對抗生素類注射劑用薄膜過濾法消除其抑菌作用而進行無菌檢查的過程中，筆者通過多年從事的微生物檢驗工作經驗，歸納總結容易遇到的問題，為相關從業人員提供借鑒。

1 常見問題及分析

1.1 供試品溶解不徹底

抗生素類固體注射劑（如密封瓶粉針劑）無菌檢查時需要溶解、轉移、稀釋后再采用薄膜過濾法過濾，在溶解稀釋的過程中，溶劑和稀釋液的種類、比例和振蕩器的使用等因素都會直接影響到供試品的溶解過濾效果。2020 年版《中華人民共和國藥典》四部無菌檢查法中收載的稀釋液有0.1%無菌蛋白胨水溶液、pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%的無菌氯化鈉溶液，試驗研究結果表明，用前兩種溶液做稀釋劑，其微生物的回收率遠高于0.9%的無菌氯化鈉溶液[3]。此外，筆者在注射用派啦西林鈉他唑巴坦鈉無菌檢查工作中，按索要到的方法進行無菌檢查，發現陽性對照菌在規定條件下未能生長，無菌試驗結果無效。經原因排查，證實是供試液溶解不徹底，過濾時濾膜吸附了大量供試品，被濾膜吸附的供試品雖經反復沖洗仍不能去除干凈，殘留在濾膜上的供試品導致陽性菌不能在規定的條件下生長。后從廠家了解到，檢驗人員在對注射用派啦西林鈉他唑巴坦鈉進行無菌檢查時，使用了促進供試品溶解的振蕩儀，但在所提供的無菌檢查方法中并未記錄振蕩操作的相關信息，從而導致監督抽檢中無菌檢查項目實驗不成立。

1.2 集菌培養器選擇不當

為了避免操作過程帶來的人為污染和人為偏差，大部分實驗室會優先選擇用一次性全封閉集菌培養器對抗生素類注射劑的供試品溶液進行過濾。全封閉集菌培養器的濾膜材質、孔徑及其與檢品的相容性是影響試驗結果的關鍵因素。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分截留效果，即抗生素類注射劑具有抑菌性，在過濾時易被濾膜吸附，須采用疏水性邊緣及低吸附的濾膜，如可選用尼龍膜材質的集菌器。無菌檢查用的薄膜過濾器的濾膜孔徑應不大于0.45 μm，該孔徑濾膜能有效截留微生物，濾膜直徑為50 mm[3]。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損。

目前市面上銷售的一次性全封閉集菌培養器的品牌、型號、規格眾多，適用的產品類型也不相同。如A 企業生產的集菌培養器：安瓿瓶裝抑菌性藥液可選用加長型取樣針，無需將樣品額外轉移，可快速轉移檢品；西林瓶裝抑菌性粉劑可選用雙針座設計，提供全封閉溶解方案，實現溶解、過濾、沖洗一體化操作，避免轉移操作；需稀釋的西林瓶裝抑菌性粉劑可選用三針座設計，溶解、稀釋、過濾、沖洗一體化操作，降低抑菌成分濃度，減少吸附。檢驗人員在選擇集菌培養器時，要結合產品溶解度、抑菌程度等以達到預期的過濾效果，選擇不當會增加沖洗液的用量并影響檢驗結果的可靠性。

1.3 沖洗方法不具體

抗生素類注射劑中有的品種抑菌作用較強，供試液過濾后還需要通過沖洗液沖洗才能消除其抑菌作用。筆者在長期抗生素類注射劑無菌檢查工作中發現，索要到的一些無菌方法驗證報告中試驗操作過程過于簡單，只是列出沖洗量和沖洗次數，沖洗量得出的過程并沒有詳細記錄，也沒有注明沖洗時的流速。如克林霉素注射液無菌檢查方法驗證結果報告中記錄的沖洗操作方法和實際操作中使用的方法不完全一致（表1）。從表1 中可以看出，方法驗證報告中沖洗方法描述比較簡單，許多需要注意的操作細節在方法驗證報告中并沒有記錄。且在大部分驗證報告中沖洗時的流速均沒有注明，而流速過快或過慢都會對實驗結果造成一定的影響，如過慢的沖洗流速不能把抑菌成分沖洗干凈，消除不了供試品的抑菌作用，而過快的沖洗流速會損傷微生物，從而導致檢驗結果不能反映供試品真實的無菌狀態[4]。

表1 克林霉素注射液方法驗證報告中的沖洗方法和實際試驗沖洗方法對比

1.4 培養基儲存不當

對于適用性檢查合格的培養基，儲存不當會導致質量降低甚至不合格，影響無菌試驗的結果。如無菌檢查中最常用的硫乙醇酸鹽流體培養基，可以在普通有氧環境下提供厭氧條件，使需氧菌和厭氧菌都能夠生長良好，并易于觀察結果[5]。2020 年版《中華人民共和國藥典》四部規定，在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/3，培養結束后，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/2。對培養基有要求，是為了確保培養基的厭氧層能夠滿足厭氧菌生長條件的需要[6]。培養基氧化層的高度多少，取決于培養基的儲存條件。不同的實驗室對配制好的無菌檢查用培養基會有不同的儲存方式，如有的實驗室用量較大，大批量配制后采用無菌灌裝，并在容器內填充氮氣，壓蓋，2 ～25 ℃儲存；有的實驗室用量不大，可用硅膠塞及紗布包裹瓶口滅菌后，2 ～8 ℃避光保存。無論采用什么條件儲存，都應該進行相關的驗證，以確定合理的保存條件，保證培養基的質量符合要求。

1.5 酶的活性降低

在抗生素類注射劑無菌檢查中，除了采用薄膜過濾法消除其抑菌作用外，針對一些抗菌作用比較強的β-內酰胺類抗生素類注射劑，還可以加入中和劑β-內酰胺酶，兩種方法聯合使用可有效消除供試品的抑菌活性。供試品過濾、沖洗完成后，在加入培養基的集菌器中加入中和劑β-內酰胺酶，使通過沖洗不能完全沖洗干凈、吸附于濾膜的少量供試品失去活性。β-內酰胺酶的使用，可以減少沖洗液的沖洗總量和沖洗次數，避免濾膜上的微生物受損壞。β-內酰胺酶的儲存條件為2 ～8 ℃，儲存溫度的不同，酶的活力也會受到不同影響。實驗室在使用此類酶的過程中，要嚴格按照產品的要求儲存，注意儲存溫度和儲存時間對酶活性的影響。儲存不當，酶的活性降低，若始終按標示的酶活性計算加入的量，加入的酶無法徹底消除供試品的抗菌作用。

1.6 陽性對照菌未按要求加入規定量

2020 年版《中華人民共和國藥典》規定應根據供試品的特性選擇陽性對照菌，陽性對照實驗的菌液制備同方法適用性實驗，加菌量不大于100 cfu[1]。筆者在監督抽檢中發現，有的廠家為了節約成本，檢驗人員用新鮮液體培養基制備好菌液，檢測一次菌液的含菌量，符合要求后就儲藏于4 ℃冰箱多次使用，而在后面的使用中均按第一次的使用量加入，并沒有每次使用時都檢測所加入菌液量是否在規定范圍內，導致企業在進行驗證時實際加入的陽性對照菌量多于規定量甚至是規定量的幾倍，陽性菌在規定培養條件下生長良好，出現了實驗成立的假象。

2 建議

2.1 加強技術審查

有關部門對生產企業上報的驗證資料應加強技術審查，規范方法驗證報告的書寫格式，提高其可操作性。對一些實驗操作不規范、實驗信息記錄不全的報告，要及時提出意見并督促其修改完善。

2.2 加強專業培訓學習

檢驗人員應執行崗前培訓制度，培訓合格方能上崗操作，還要持續參加各類業務學習，掌握無菌檢驗方法、標準及相關法律法規。有關部門應組織長期從事無菌檢查工作的專家，對于抗生素類注射劑方法驗證中的重點、難點等注意事項以及可能出現的問題，給予相關從業人員技術指導。

2.3 提高相關企業檢測能力

有關部門應督促企業參加各類水平測試和盲樣測試，提高檢測水平和分析問題、解決問題的能力。

3 結語

針對薄膜過濾法在抗生素類注射劑無菌檢查中的使用，相關單位和技術人員要加強總結和培訓，提高結果測定準確度，保證方法的應用成效。