腐熟羊糞有機肥配施無機肥對植煙土壤微生物群落結構和多樣性的影響①

溫烜琳，馬宜林，周俊學，高佳凱，張水源，張 楓，申 欣，王悅華，申洪濤，元 野，李友軍，劉 領*

腐熟羊糞有機肥配施無機肥對植煙土壤微生物群落結構和多樣性的影響①

溫烜琳1，馬宜林1，周俊學2*，高佳凱1，張水源3，張 楓3，申 欣4，王悅華1，申洪濤5，元 野6，李友軍1，劉 領1*

(1 河南科技大學農學院，河南洛陽 471023；2 河南省煙草公司洛陽市公司技術中心，河南洛陽 471000；3 河南省煙草公司洛陽市公司宜陽縣分公司，河南宜陽 471600；4 河南省煙草公司洛陽市公司嵩縣分公司，河南嵩縣 471400；5 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州 450000；6 黑龍江省煙草公司牡丹江煙草科學研究所，黑龍江牡丹江 157011)

為了探究腐熟羊糞有機肥與無機肥配施對洛陽煙區植煙土壤微生物群落結構和土壤肥力特性的影響，采用盆栽控制試驗和高通量測序技術，研究了不施肥(CK)、100% 無機氮肥(T0)、50% 羊糞有機肥氮+50% 無機氮肥(T50)和100% 羊糞有機肥氮(T100)4個處理下植煙土壤細菌和真菌群落結構及多樣性的差異，并結合土壤理化性質分析了土壤肥力指標與土壤微生物多樣性的關系。結果表明：植煙土壤細菌優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，土壤真菌優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)；T50處理的變形菌門、酸桿菌門和子囊菌門相對豐度最高，但放線菌門和擔子菌門相對豐度最低；NMDS分析和相似性分析發現，T50處理的土壤微生物群落結構與其他處理差異顯著；Alpha多樣性分析也表明，T50處理土壤細菌和真菌群落的豐富度和多樣性最高。不同處理土壤理化性質和土壤關鍵酶活性差異顯著，以T50處理土壤養分含量和土壤碳氮代謝酶的活性最高；Pearson相關性分析顯示，土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量及蛋白酶和脲酶活性與植煙土壤微生物多樣的關系最為密切?？傊?，采用腐熟羊糞有機肥和無機肥配施通過影響植煙土壤細菌和真菌群落結構和多樣性，促進了土壤養分的釋放和轉化，有利于土壤養分的供應和土壤質量的提升，研究結果為洛陽煙區應用羊糞有機肥改良土壤提供了理論依據。

腐熟羊糞有機肥；烤煙；土壤養分；土壤酶活性；細菌；真菌；多樣性和群落組成

土壤微生物是土壤生態系統中重要的組成成分，在維持土壤生態系統平衡、促進土壤養分循環、保障作物正常生長發育方面發揮著重要作用，是反映土壤健康的重要指標[1]。前人研究發現，有機肥與化肥配施，能夠增加土壤細菌和真菌群落的豐富度和多樣性指數，改變土壤微生物群落結構[2-3]。但是由于有機肥種類和土壤類型的不同，有機肥和化肥配施對土壤微生物的影響目前還存在較大差異。王慶等[4]研究發現，化肥減量配施有機肥能夠增加土壤細菌的多樣性，但對土壤真菌多樣性沒有影響；而李正輝等[5]研究則表明，羊糞有機肥的施用對土壤真菌的群落結構影響尤為顯著。

烤煙是我國重要的經濟作物之一。近年來，由于無機肥料的不合理施用，造成土壤酸堿平衡失調、土壤生物活性降低以及土壤肥力下降等問題，嚴重影響了煙田的土壤健康和煙區的可持續發展[6]。施用有機肥能夠降低土壤容重，改善土壤細菌群落結構和土壤養分供應能力，有利于土壤培肥和健康[7-8]。羊糞有機肥是常見的有機肥類型之一。前人研究表明，羊糞有機肥替代化肥減量配施，能夠改善土壤肥力，增加土壤微生物多樣性，建立更適合作物生長的微生物區系[9]。然而，煙田配施羊糞有機肥對植煙土壤的改良效應及其微生態機制，仍不十分清楚。本課題前期研究發現，40% ～ 60% 羊糞有機肥替代化肥與化肥配施能夠促進烤煙生長發育，維持土壤肥力[10]，但是并未對土壤微生物多樣性進行深入探究。因此，本研究采用高通量測序技術，進一步分析了腐熟羊糞有機肥與化肥配施對植煙土壤微生物群落結構和多樣性的影響，旨在為洛陽煙區合理利用羊糞有機肥改良煙田土壤提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年在河南省洛陽市河南科技大學進行。供試土壤釆自河南科技大學農場0 ～ 20 cm耕層，除去石子等雜物后風干過2 mm篩備用。土壤類型為黃潮土，基本理化性質為pH 7.6，有機質12.32 g/kg，全氮0.84 g/kg，堿解氮43.70 mg/kg，有效磷14.10 mg/kg，速效鉀102.10 mg/kg。供試烤煙品種為中煙101，煙苗由洛陽市宜陽縣煙草公司集中漂浮育苗。供試羊糞有機肥(有機質497.0 g/kg、氮14.2 g/kg、磷13.2 g/kg、鉀24.4 g/kg)由河南正輝肥業有限公司生產；供試無機肥為復合肥(N∶P2O5∶K2O=18∶18∶18)、過磷酸鈣(P2O5，160 g/kg)和硫酸鉀(K2O，500 g/kg)。

1.2 試驗設計

試驗采取盆栽受控試驗，共設4個處理，分別為：CK(不施肥)、T0(100% 無機氮肥)、T50(50% 羊糞有機肥氮+50% 無機氮肥)、T100(100% 羊糞有機肥氮)，每處理重復4次，共16盆。3個施肥處理T0、T50和T100，按N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3進行配施，確保各處理氮、磷、鉀等量施用，具體施肥比率和用量見表1。于煙苗移栽60 d后，用抖根法采集烤煙根際土壤，混合均勻，一部分風干用于測定土壤養分含量和土壤酶活性，另一部分裝入無菌離心管，放入液氮保存，用于DNA提取。

表1 不同處理肥料配比和用量

1.3 測定項目與方法

參照鮑士旦[11]的方法測定土壤有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀含量。參照關松萌[12]的方法測定土壤酶活性。其中，土壤蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，以1 g土壤在37℃ 培養24 h后生成的葡萄糖的質量(mg/(g·d))表示；土壤蛋白酶活性采用加勒斯江法測定，以1 g土壤在37℃ 培養24 h后生成的甘氨酸的質量(mg/(g·d))表示；土壤脲酶活性采用苯酚鈉–次氯酸鈉比色法測定，以1 g土壤在37℃ 培養24 h后產生的NH3-N的質量(mg/(g·d))表示。

采用土壤DNA提取試劑盒(Fast DNA? Spin Kit for Soil)進行土壤DNA提取，將純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈反應(PCR)的模板。細菌擴增引物采用515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CC GTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)，真菌ITS1區段擴增引物采用ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G-3′)和ITS4(5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′)。PCR采用25 μL反應體系：10倍PCR buffer 5 μL，dNTP 0.5 μL，正向反向引物各0.5 μL，Tap酶0.25 μL (250 U)，DNA模板1 μL，dH2O補齊至25 μL。PCR反應策略：98℃預變性3 min，98℃ 15 s，50℃ 30 s和72℃ 30 s，共27個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。

Illumina PE250測序：將同一樣本的PCR產物混合后用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2% 瓊脂糖電泳檢測。并用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量。使用Illumina PE250構建文庫：①連接“Y”字形接頭；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴增進行文庫模板的富集；④氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的PE250平臺進行測序(上海元莘生物醫藥科技有限公司)。

1.4 數據處理與分析

使用fastp[13]軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH[14]軟件進行拼接：①過濾read尾部質量值20 bp以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20 bp，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的read；②根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長度為10 bp；③拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩除不符合序列；④根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。然后，使用Usearch[15]軟件對所有序列進行OTU在97% 相似水平下的劃分，采用RDP classifier貝葉斯算法對97% 相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，使用Mothur軟件計算細菌和真菌群落的Alpha多樣性指數(ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數)。

采用Excel 2016軟件進行數據處理，圖表中數據為平均值±標準誤。采用SPSS 22.0統計軟件對土壤養分、土壤微生物Alpha多樣性和群落結構等數據進行多重比較、方差分析和相關性分析，使用Origin 9.5對土壤微生物群落多樣性與土壤環境因子的Pearson分析、土壤微生物群落組成和NMDS (非度量多維尺度)分析進行作圖，采用圖圖云平臺(https://www.cloudtutu.com)和Adobe Illustrator 2021對ANOSIM相似性分析進行作圖。

2 結果與分析

2.1 腐熟羊糞有機肥與無機肥配施對土壤養分含量和酶活性的影響

由表2可知，不同施肥處理間土壤養分含量和酶活性存在顯著差異。土壤有機質含量和蔗糖酶活性表現為T100>T50>T0>CK，以單施有機肥的T100處理最高，且T100處理的有機質含量顯著高于其他處理，但蔗糖酶活性在T100和T50處理之間沒有顯著差異；有效磷含量、速效鉀含量和蛋白酶活性均表現為T50>T100>T0>CK，以有機肥和無機肥配施的T50處理最高，且顯著高于其他處理；堿解氮含量和脲酶活性表現為T50>T0>T100>CK，均以T50處理最高，且顯著高于其他處理。

表2 腐熟羊糞有機肥與無機肥配施對土壤養分含量和酶活性的影響

注：表中同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(<0.05)；下同。

2.2 腐熟羊糞有機肥與無機肥配施對土壤微生物群落多樣性的影響

土壤微生物的豐富度用ACE和Chao1指數表征，多樣性用Shannon和Simpson指數表征。由表3可知，T50處理的土壤細菌和真菌OTU數量最多，ACE、Chao1和Shannon指數最高，Simpson指數最低。土壤細菌的OTU數量、ACE和Chao1指數均表現為T50>T100>CK>T0；土壤細菌的Shannon指數以及土壤真菌的OTU數量、ACE和Chao1和Shannon指數均表現為T50>T0>T100>CK；土壤細菌的Simpson指數表現為T50

2.3 土壤微生物群落多樣性與土壤環境因子的關系

通過Pearson分析(圖1)發現，土壤細菌的OTU數量、ACE、Chao1和Simpson指數與土壤環境因子相關性不明顯，Shannon指數與堿解氮、有效磷、速效鉀含量和脲酶活性均呈極顯著正相關關系，與蛋白酶活性呈顯著正相關關系。土壤真菌的OTU數量、ACE、Chao1和Shannon指數均與堿解氮、有效磷、速效鉀含量和蛋白酶活性呈極顯著正相關關系，與脲酶活性呈顯著正相關關系；Simpson指數與堿解氮、有效磷、速效鉀含量和脲酶活性均呈極顯著負相關關系，與蛋白酶活性呈顯著負相關關系。說明土壤環境因子變化對土壤真菌的豐富度和多樣性影響更為明顯，其中土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量和蛋白酶、脲酶活性的變化是影響土壤微生物群落多樣性的重要環境因子。

(圖A：細菌；圖B：真菌；*和**表示在P<0.05和P<0.01水平上顯著相關)

2.4 腐熟羊糞有機肥與無機肥配施對土壤微生物群落組成的影響

由圖2A可知，各處理土壤細菌群落的優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，平均相對豐度分別為24.76%、23.94% 和14.71%。由圖2B可知，T50處理的變形菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和裝甲菌門(Armatimonadetes)的相對豐度最高，放線菌門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度最低，其中T50處理的放線菌門顯著低于其他3個處理。浮霉菌門(Planctomycetes)的相對豐度表現為T100CK>T50>T0。

由圖3A可知，各處理土壤真菌群落的優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，平均相對豐度分別為62.85% 和31.31%。由圖3B可知，與CK處理相比，施肥處理顯著提高了子囊菌門和接合菌門(Zygomycota)的相對豐度，顯著降低了擔子菌門的相對豐度，T50處理具有最高的子囊菌門和接合菌門相對豐度，最低的擔子菌門相對豐度。

(圖A：細菌門水平的相對豐度；圖B：細菌門水平的顯著差異分析；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同)

(圖A：真菌門水平的相對豐度；圖B：真菌門水平的顯著差異分析)

2.5 腐熟羊糞有機肥與無機肥配施對土壤微生物群落結構的影響

由圖4A所示，沿X軸CK、T0、T50和T100處理之間有一定距離，但是分離不明顯，說明施肥與否能夠改變土壤細菌的群落結構，但不同處理對土壤細菌群落結構影響差異不明顯。相比土壤細菌的群落結構，4個處理土壤真菌的群落結構分離趨勢更明顯；沿X軸CK處理與施肥處理分離明顯，但各施肥處理間分離趨勢不明顯(圖4B所示)，說明施肥能夠明顯改變土壤真菌的群落結構，但不同的施肥處理對土壤真菌群落結構影響差異不明顯。由圖5可知，當組間距離大于處理距離時，說明組間差異大于組內差異，值與值則說明組間差異達到了顯著水平。由圖5A可知，對于土壤細菌，施肥處理與CK處理相比差異不顯著，但T50處理與T0、T100處理差異顯著；由圖5B可知，對于土壤真菌，各處理間具有顯著差異。

圖5 腐熟羊糞有機肥配施無機肥下土壤細菌(A)和真菌(B)相似性分析

3 討論

土壤速效養分含量反映了土壤的供肥能力，與煙株的生長發育及產量形成密切相關[10]。本研究表明，相比于不施肥(CK)、單施化肥(T0)和單施有機肥(T100)處理，50% 羊糞有機肥氮+50% 無機氮肥(T50)處理顯著地提高了煙株移栽60 d后土壤堿解氮、有效磷和速效鉀的含量，而且相比于CK和T0處理也顯著地提高了土壤有機質的含量，說明T50處理兼具供肥和土壤改良效果。土壤酶是土壤中較為活躍的有機成分，在土壤養分循環中發揮著重要作用，其中土壤蔗糖酶、脲酶和蛋白酶是驅動土壤碳氮元素循環的關鍵酶[16]。趙霞等[17]在甘肅省張掖市通過施用不同比例的羊糞有機肥發現，施用羊糞有機肥處理土壤蔗糖酶和脲酶活性與單施化肥處理相比顯著增加。秦秦等[18]在常州市研究不同量生物有機肥與化肥減量配施發現，高量生物有機肥與化肥配施可以增加土壤蔗糖酶和蛋白酶的活性。本研究結果也發現，不同施肥處理對土壤酶活性的影響有明顯差異，T50處理土壤蔗糖酶、脲酶和蛋白酶活性均最高。究其原因，羊糞有機肥和化肥配施一方面兼顧了無機氮源對土壤微生物的啟動作用，另一方面施入土壤后的腐熟羊糞有機肥為微生物生長提供了大量碳源，有利于微生物增殖，從而提高土壤酶活性[19]。

土壤微生物是土壤微生態的重要組成成分，是驅動土壤養分循環的關鍵因子，對維持土壤質量及促進植物生長等具有重要作用[20]。本研究發現，相較其他處理，T50處理的土壤細菌豐富度和多樣性最高。王亞麟等[21]在貴州的長期定位施肥試驗也表明，有機肥與化肥配施能夠提高土壤細菌多樣性和豐富度。本研究結果還表明，施肥處理均較不施肥處理顯著增加了土壤真菌的多樣性，且以T50處理土壤真菌多樣性最高，這與Luo等[22]通過研究豬糞、礦質氮、磷酸鹽和鉀肥混合施入土壤能夠顯著增加土壤真菌多樣性的結果是一致的。有機肥與無機肥配施對土壤細菌和真菌的促生作用與無機肥的啟動作用(氮源)和有機肥的底物作用(碳源)耦合有關[23]。本研究通過分析不同處理土壤細菌群落的組成發現，植煙土壤細菌群落的優勢菌門主要為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門；T50處理能夠提高變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，降低放線菌門的相對豐度。由于變形菌門的主要功能為提高土壤氮肥利用率[24]，而酸桿菌門的主要功能為參與腐殖質分解的碳循環過程及維持土壤生態系統健康[25]，進一步印證了腐熟羊糞有機肥與化肥配施在提升植煙土壤供肥能力和維持土壤碳氮平衡方面的作用。放線菌門的變化則可能與土壤團聚體大小有關。有研究表明，有機肥與化肥配施能夠顯著提高土壤的團聚性，而土壤團聚體粒徑的增加則會導致放線菌門的相對豐度降低[26]。通過分析不同處理土壤真菌群落的組成發現，子囊菌門和擔子菌門是本研究植煙土壤真菌群落的優勢菌門，T50處理提高了子囊菌門的相對豐度，但降低了擔子菌門的相對豐度。子囊菌門的主要功能為參與土壤有機質分解，尤其具有分解木質纖維素的能力，因此子囊菌門的相對豐度升高有利于植煙土壤外源有機質的礦化和養分釋放[27]。擔子菌門主要出現在貧瘠的營養環境中，與土壤的C/N比呈顯著負相關關系[28]。本研究中，羊糞有機肥的添加通過影響土壤C/N比，導致了擔子菌門相對豐度的降低。

Pearson相關性分析發現，供試植煙土壤的速效養分含量和酶活性與土壤中細菌的Shannon指數、真菌的多樣性和豐富性指數(ACE、Chao1和Shannon指數)呈顯著正相關關系，與土壤真菌的Simpson指數呈顯著負相關關系，表明土壤真菌群落結構的豐富度和多樣性較土壤細菌群落更容易受到施肥的影響。這是因為土壤真菌主要存在于團聚體表面，相對于細菌更容易受到微環境變化的影響[29]。Suzuki等[30]研究也發現，土壤真菌群落結構對有機肥和無機肥配施的響應比土壤細菌群落結構更為敏感。

4 結論

腐熟羊糞有機肥配施無機肥顯著影響植煙土壤肥力、酶活性及土壤細菌和真菌群落結構。土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量及蛋白酶和脲酶活性與土壤微生物群落多樣性的關系密切。有機肥與無機肥配施通過調控土壤有機質含量和微生物的多樣性，進而影響植煙土壤的供肥能力和土壤質量。腐熟羊糞有機肥與無機肥配施(T50)處理增加了土壤微生物的多樣性和豐富度(尤其是土壤真菌)，顯著提高了土壤優勢菌門的相對豐度，有利于改善植煙土壤的供肥能力，提升土壤質量，在豫西煙區具有較大的推廣價值。

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Effects of Combined Application of Organic Manure and Inorganic Fertilizer on Structure and Diversity of Microbial Community in Tobacco-growing Soil

WEN Xuanlin1, MA Yilin1, ZHOU Junxue2*, GAO Jiakai1, ZHANG Shuiyuan3, ZHANG Feng3, SHEN Xin4, WANG Yuehua1, SHEN Hongtao5, YUAN Ye6, LI Youjun1, LIU Ling1*

(1 College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471023, China; 2 Technology Center, Luoyang Branch of Henan Provincial Tobacco Corporation, Luoyang, Henan 471000, China; 3 Yiyang Branch, Luoyang Company of Henan Tobacco Company, Yiyang, Henan 471600, China; 4 Songxian Branch, Luoyang Company of Henan Tobacco Company, Songxian, Henan 471400, China; 5 Technology Center, China Tobacco Henan Industrial Limited Company, Zhengzhou 450000, China; 6 Mudanjiang Tobacco Science Research Institute, Heilongjiang Provincial Tobacco Company, Mudanjiang, Heilongjiang 157011, China)

In order to explore the influences of combined application of sheep manure-derived organic fertilizer and chemical fertilizer on soil microbial community structure and soil fertility in tobacco-growing area of Luoyang, a pot experiment was conducted and high-throughput sequencing techniques was used to study the differences in community structure and diversity of soil bacteria and fungi under four fertilization treatments, no fertilizer (CK), 100% inorganic nitrogen fertilizer (T0), 50% sheep manure organic nitrogen fertilizer +50% inorganic nitrogen fertilizer (T50), and 100% sheep manure organic nitrogen fertilizer (T100). And the relationship between soil physiochemical properties and soil microbial diversity were analyzed. And the results showed that the dominant soil bacteria phyla were Proteobacteria, Acidobacteria and Actinobacteria, while the dominant soil fungi phyla were Ascomycota and Basidiomycota. Compared with other treatments, T50 had the highest relative abundances in Proteobacteria, Acidobacteria and Ascomycota and the lowest relative abundances of in Actinobacteria and Basidiomycota. NMDS analysis and similarity analysis showed that soil microbial community structure of T50 was significantly different from those of other treatments. Alpha diversity analysis also showed that T50 had the highest richness and diversity of bacterial and fungal communities. Soil physicochemical properties and soil key enzyme activities were significantly different under the four treatments, and T50 had the highest soil nutrient contents and soil carbon and nitrogen metabolizing enzyme activities. Pearson correlation analysis showed that soil alkali-hydrolyzed nitrogen, available phosphorus, available potassium, protease and urease activities were most closely related to soil microbial diversity. In summary, combined application of sheep manure-derived organic fertilizer and chemical fertilizers can promote the release and transformation of soil nutrients by affecting the community structure and diversity of soil bacteria and fungi, which are conducive to the supply of soil nutrients and the improvement of soil quality. The results provide a theoretical basis for the application of sheep manure-derived organic fertilizer to improve soil quality in tobacco-growing areas of Luoyang.

Sheep manure-derived organic fertilizer; Flue-cured tobacco; Soil nutrients; Soil enzyme activities; Soil bacteria; Soil fungi; Diversity and community composition

S572；S158

A

10.13758/j.cnki.tr.2023.04.014

溫烜琳, 馬宜林, 周俊學, 等. 腐熟羊糞有機肥配施無機肥對植煙土壤微生物群落結構和多樣性的影響. 土壤, 2023, 55(4): 804–811.

河南省重點研發與推廣專項(科技攻關)項目(212102110286)，河南省煙草公司洛陽市公司項目(LYKJ202003)和河南中煙工業有限責任公司項目(2020410001340006) 資助。

(910675295@qq.com; liulinghenan@126.com)

溫烜琳(1997—)，女，河南洛陽人，碩士研究生，主要研究方向為煙草栽培與土壤生態。E-mail: 17839373795@163.com