有氧運動對糖尿病大鼠血管內皮功能的影響及網膜素的作用

田清華 孫培帥 劉霞 金其貫 胡潤東

(1湖南師范大學體育學院,湖南 長沙 410012;2揚州大學體育學院;3聊城幼兒師范學校)

糖尿病是由于胰島素分泌缺陷或作用障礙所致的,以高血糖為特征的代謝性疾病,可由多種細胞和分子途徑異常引發。機體長期處于高血糖環境,可引發多種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害及功能障礙〔1〕。Brownlee〔2〕認為機體長時間處于高糖的刺激下,會產生相應的氧化應激,進而引起組織損傷。血管內皮結構是維持血管內環境穩定的重要屏障,其結構缺陷和功能障礙是各種心血管疾病產生的病理基礎。糖尿病血管內皮功能障礙主要由氧化應激與炎癥引起,引起途徑主要是一氧化氮(NO)生產障礙和NO激活障礙〔3〕。劉菊等〔4〕研究表明,機體的血同型半胱氨酸(Hcy)產生過多時,會降低機體的抗氧化能力,影響血管內皮細胞正常代謝,進而破壞內皮細胞的功能發揮,加速了微血管病變的進程。

網膜素(omentin)是近年發現的新型特異性脂肪因子,實驗表明omentin-1在維持能量代謝平衡,提高胰島素致敏性,抑制機體炎癥反應和降低心血管發病概率等扮演關鍵角色。omentin通過不同調節機制參與調節炎癥反應、氧化應激反應和增加NO的生成。就內皮功能而言,網膜蛋白可通過激活一氧化氮合酶(eNOS)加強血管舒張功能,并且可以經omentin-1/三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABC)A1途徑,降低主動脈粥樣硬化的發展〔5〕。omentin水平與內皮功能之間有很大的關系,特別是高危糖尿病患者,omentin對內皮功能障礙具有顯著性保護作用〔6〕。Wang等〔7〕指出,omentin可以促進eNOS的表達,刺激蛋白激酶B(Akt)-eNOS信號通路,機體NO的生成增加,從而促進缺血反應中的內皮細胞功能和血運重建能力。Liu等〔8〕指出,omentin-1通過抑制氧化應激并通過激活腺苷酸活化蛋白激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體(AMPK/PPAR)γ途徑增加NO的產生來預防高糖誘導的血管內皮功能障礙。

研究表明,12 w有氧運動可以明顯降低體重和胰島素抵抗,同時omentin表達水平顯著提高〔9〕。有氧運動是否通過增加omentin來改善糖尿病血管內皮功能,其機制又如何。本研究將探討糖尿病大鼠血管內皮功能、有氧運動及omentin之間的關系及在運動干預下omentin/AMPK/eNOS通路對糖尿病血管內皮的作用。

1 材料與方法

1.1動物分組與建模 將40只6周齡SPF級雄性SD大鼠,每籠5只分籠飼養。光照為自然光,環境溫度濕度適宜,并每天早上更換墊料。保持動物房通風、干凈。在進行實驗前適應喂食3 d,喂養結束后將大鼠隨機分為2組,分別為對照組(NC組,n=10)和糖尿病建模組(DM組,n=30)。 對照組用普通飼料進行喂養,糖尿病建模組用高脂質飼料進行喂養(配合:基礎飼料占比72.5%,豬油占比12%,蔗糖占比9%,大豆粉末占比3%,膽固醇占比2%,膽汁鹽占比1.5%)。進行4 w飼養后,糖尿病建模組的大鼠進行12 h的禁食,并且在腹部注射鏈尿佐菌素(STZ)溶液40 mg/kg。1 w后測定糖尿病組大鼠尾靜脈中的血糖濃度,血糖濃度>11.1 mol/L,而且明顯出現三多一少的癥狀,說明成功建立了糖尿病組的模型。一共有27只大鼠建模成功,將建模成功后27只大鼠分為糖尿病對照組(DMC組,n=9)和糖尿病運動組(DME組,n=18),DME組實施設計好的運動方案進行運動干預。

1.2運動方案 糖尿病運動組運動持續時間為8 w,訓練內容為無負重游泳訓練,每周進行6 d的訓練,訓練時間為1 h/次,在方案執行過程中應注意:(1)觀察大鼠運動中狀態,防止大鼠溺亡。(2)保持泳池衛生和最佳溫度,為大鼠運動提供適宜環境。每周大鼠休息日測體質量、快速血糖儀測血糖以備統計。

1.3動物取材及處理 大鼠最后一次運動后,禁食不禁水。第二天(12 h后)將大鼠進行麻醉注射,注射完成后對大鼠的靜脈進行取血。取血完成后,將取得的血液放入血清促凝管中進行靜置保存,保存時間為30 min,30 min后將血液進行離心操作,隨后吸取血清并將其保存在-20 ℃冰箱,用來準備測量血液中的各項指標〔空腹血糖(FBG)、omentin、NO、血清胰島素(INS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)〕。取2 cm干凈胸主動脈血管組織放入2.8%的戊二醛溶液中固定,以備后期電鏡掃描。另取胸主動脈血管組織長度為2 cm,并將其固定放入10%的甲醛溶液中,目的是準備蘇木素-伊紅(HE)染色。將余下的主動脈組織保存在溫度為-80 ℃的冰箱內,目的是準備用來測蛋白、mRNA和含量。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=INS×FBG/22.5。

1.4血管組織HE染色 采集固定的胸主動脈血管組織并脫水,用包埋機包埋蠟浸過的組織,制造蠟并冷卻。冷卻結束后修正冷卻后的蠟塊,隨后將蠟塊進行切片、撈片,最后用烘干箱將其烘干,用來準備進行HE染色。經過洗脫、透明、封片后鏡下觀察其顯微結構并攝影,觀察其血管內皮組織結構的變化。

1.5血管組織掃描電鏡觀察 取完大鼠血液,用棉球將腹腔遺留血液擦拭干凈后,取米粒大小胸主動脈血管組織,馬上將其放入提前準備好的2.8%戊二醛中,環境溫度為4 ℃,固定時間為2 h以上。在此之前2.8%戊二醛固定2 h以上,4 ℃冰箱,用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)來清洗,一共將其清洗3～4次,每次的清洗時間為15 min,隨后1%的鵝酸固定2 h,用0.1 mmol/L PBS來清洗,共將其清洗3～4次,每次的清洗時間為15 min,隨后放入乙醇中進行梯度脫水,其中乙酸乙戊酯與乙醇比例為1∶1,梯度脫水時間為0.5 h,隨后將其放入純乙酸乙戊酯中時間為0.5 h,接下來進行CO2臨界點干燥、黏樣、鍍膜等步驟,完成后將其放在鏡下進行觀察。

1.6大鼠血清指標測試 血清中FBG含量用葡萄糖氧化酶法測定,血清中NO含量用硝酸還原酶法測定,血清中HDL、LDL、TC、TG含量用分光光度法測定。

1.7大鼠胸主動脈omentin、AMPK、 eNOS 、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量的測定 采用二喹啉甲酸(BCA)方法測定大鼠胸主動脈總蛋白濃度。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測試血清胰島素、胸主動脈組織中omentin、ΑMPK和eNOs含量。實驗過程:準備預包被微板,依次加入大鼠蛋白,標準品進行孵育,隨后加入抗體生物素,辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體在孵育完全后加入,隨后進行徹底的洗滌。最后發現洗滌后的樣板底物在過氧化酶和酸的作用下顯現出黃色,放入酶標儀中,以波長450 nm進行OD值測定并計算樣品濃度。

1.8大鼠主動脈組織中c-Jun氨基末端激酶(JNK)mRNA、環氧化酶(Cox)-2 mRNΑ的測定 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測主動脈組織JNK mRNA、Cox-2 mRNΑ,從大鼠主動脈中提取總RNA,吸光度值用分光光度計測定,測定完成后計算相對濃度,判斷所提取RNA純度。PCR儀(美國)中,cDNA的合成過程嚴格按照cDNA合成試劑盒說明書進行合成,合成后的cDNA的保存條件為-20 ℃。以cDNA為模板,以GAPDH為內參,在PCR儀中反應。反應結束后,計算得到目的基因Ct值的相對轉錄水平。

在上海生物工程有限公司選購JNK、Cox-2 的引物,引物序列:JNK上游引物:TCCCAGTCTTCGATGCTCTT 50%GC〔指引物的堿基充列中含有鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)堿基的百分比〕,引物的溶解溫度(M)59.27 ℃、下游:TTACAAGCCAGGTGTGAACG 50%GC,M 60.13 ℃,COX-2上游引物:CTGGAAACCTAGCACCTTCG 50%GC,M 60.65 ℃、下游:TGAAAGAGGCAAAGGGACAC 50%GC,M 60.00 ℃,GAPDH上游引物:ACAGCAACAGGGTGGTGGAC 60%GC,M 60.62 ℃、下游:TTTGAGGGTGCAGCGAACTT 50%GC,M 60.47 ℃。

1.9統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.13組血清FBG、INS及HOMA-IR 與NC組比較,DMC組血清FBG和HOMA-IR水平顯著增加(P<0.05),血清INS水平無明顯變化(P>0.05);與DMC組比較,DME組血清FBG水平顯著下降(P<0.05),見表1。

表1 各組血清FBG、INS、HOMA-IR、TG、TC、HDL、LDL含量比較

2.2各組血清中血脂的變化 與NC組比較,DMC組血清TG,TC均顯著升高(P<0.05);與DMC組比較,DME組血清TG水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3各組血清NO、主動脈eNOS含量的變化 與NC組比較,DMC組NO、eNOs水平均顯著下降(P<0.05,P<0.01);與DMC組比較,DME組NO、eNOS含量均顯著增加(P<0.05),見表2。

表2 各組血清NO、主動脈組織eNOS含量的變化

2.43組主動脈HE染色、掃描電鏡下觀察結果 通過HE染色觀察血管內皮發現,NC組血管內皮細胞光滑,組織排列緊密,細胞核排列整齊分布均勻。DMC組血管內皮的組織出現疏松現象,并且出現了不同程度的隆起。DME組與DMC組相比其血管內皮的隆起部分有所減小,血管內皮組織排列較緊密,細胞核的分布形態呈線狀。 通過掃描電鏡下觀察發現,NC組血管內皮表面光滑平整、結構清晰,可觀測到少量微絨毛;細胞飽滿,充滿光澤,呈條帶狀有序分布;細胞間形態和大小基本一致,且界限明晰,連接緊密。DMC組內皮形態顯著異常,在內皮表面出現褶皺,并且其結構雜亂,內皮表面絨毛也已消失;內皮細胞萎靡,沒有光澤,紊亂排列且間隙增大;表面可觀測到明顯的細胞膜缺損及附著在表皮上脫落的細胞碎片和纖維。DME組內皮表面形態出現異常但不明顯,膜表面結構及排序混亂無序,褶皺部分不明顯,有些許的細胞碎片附著在細胞表面,隱約可見表面微絨毛。見圖1。

圖1 各組主動脈血管形態

與NC組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與DMC組比較:3)P<0.05,4)P<0.01

2.5各組血清和主動脈血管網膜素及AMPK含量 與NC組比較,DMC組血清omentin水平、血管omentin表達水平、主動脈血管AMPK含量均顯著下降(P<0.05,P<0.01);與DMC組比較,DME組血清和組織omentin水平及AMPK含量均顯著升高(P<0.05),見表2。

2.6各組主動脈組織TNF-α含量、JNK、Cox-2 mRNΑ表達 與NC組比較,DMC組TNF-α含量、JNK、Cox-2 mRNΑ表達量均顯著升高(均P<0.01);與DMC組比較,DME組TNF-α含量、JNK、Cox-2 mRNΑ表達量顯著降低(P<0.05,P<0.01),見表2。

3 討 論

血管內皮在受到生物體的血糖、血脂代謝異常產物和炎癥因子等有害物質的刺激,其穩態會受到破壞,進而導致血管內皮功能障礙〔10〕。血管內皮細胞功能障礙是產生糖尿病及其并發癥的病理基礎〔11〕。臨床和基礎研究表明,糖尿病合并并發癥的產生是由于糖尿病患者機體糖脂代謝異常導致氧化應激和炎癥反應,進而引起血管內皮細胞分泌內皮依賴性調節蛋白失衡從而造成大血管、微血管病變〔12〕。Babbitt等〔13〕發現,運動能有效改善T2DM血管內皮功能障礙、提高機體胰島素敏感性、降低糖尿病心血管并發癥發生概率。本實驗研究表明,8 w有氧運動后,DME組主動脈血管內皮輕微隆起,表皮附著些許碎片,組織厚度減小;細胞核排列緊湊,細胞之間間隙變小,較DMC組均有所改善。

糖尿病產生內皮功能障礙的主要因素之一就是血管舒張因子NO的生物-合成減少〔14～16〕。eNOS通過介導NO的合成,進而參與血管內皮形態和功能的調節。正常生理狀態下,機體內NO主要受內皮細胞中eNOS及其上游因子調節〔17〕。在病理狀態下,由于氧化應激等各種原因會解耦eNOs合成NO路徑且直接滅活NO,而運動可通過蛋白磷酸化機制提高機體eNOs的表達,從而平衡NO的產生與利用〔18〕。研究發現,在高血糖,高血脂等影響下,2型糖尿病患者的eNOS磷酸化水平降低,內源性NO釋放受到抑制,造成血管舒縮兩端失衡,內皮通透性改變,進而引起血管內皮功能紊亂〔19～21〕。張鵬程等〔22〕通過研究發現:在進行有氧運動聯合抗阻運動干預8 w后,顯著增加eNOS表達量,促進NO、VEGF的分泌。本實驗結果提示,長期的有規律的有氧運動可增加eNOS和NO的含量,從而保護血管內皮功能。

omentin是一個在內臟脂肪組織中選擇性高表達的新型脂肪源性脂肪因子,omentin可以分為omentin-1和omentin-2,通過研究發現,omentin-1在血液循環中的表達遠遠大于omentin-2〔23〕。omentin具有抑制炎癥反應、抑制胰島素的敏感性等作用。omentin不僅通過調節血管功能和降低環氧合酶-2的表達來抑制血管炎癥,還參與了糖脂代謝的能量轉換過程〔24〕。有研究發現,omentin可以有效反映血管內皮功能是否發生障礙,可以作為測試內皮功能的生物指標〔25〕。張霞〔26〕研究發現,糖尿病患者體內血漿omentin水平顯著降低與本研究結果一致。

omentin-1的內皮保護作用通過調節NO實現的,omentin可增加皮瓣成活面積百分比、表皮厚度、新生血管數量、eNOS活性〔27〕。有研究發現大鼠血管omentin重組后,omentin/eNOS/NO通路可以改善大鼠血管舒張功能障礙〔28〕。Xu等〔29〕和Kazama等〔30〕發現,在體內外,omentin-1可誘導AMPK和Akt的活化,一方面通過AMPK/Akt信號通路抗動脈鈣化,另一方面omentin可通過AMPK/NO信號通路,使血管舒張彈性得以增加,血管舒縮平衡得以改善。TNF-α水平在糖尿病小鼠的心臟的血管系統的內皮增加,已被鑒定為沉淀血管功能障礙的關鍵介導物。omentin可以通過AMPK/eNOS/NO途徑從而減輕炎癥反應,糖尿病血管內皮功能障礙的發生發展進程從而得到延緩〔31〕。Yamawaki等〔32〕認為,omentin可以激活蛋白激酶/eNOS信號通路從而來抑制JNK、TNF-α等炎性因子的產生。本實驗也表明,omentin水平和AMPK、eNOS水平呈正相關,因此能夠促進NO的產生,改善內皮功能障礙。另外,NO與JNK、TNF-α含量呈顯著負相關。通過實驗研究發現,DMC組大鼠血管中omentin的表達水平明顯低于NC組大鼠和DME組大鼠,AMPK和eNOS水平隨著糖尿病血管內皮病變的程度相應減少。推測,在糖尿病血內皮功能的變化過程中,omentin與AMPK/eNOS/NO通路有很大的關系,并與阻止JNK通路、抑制TNF-α誘導的炎癥有關。

耐力訓練或飲食干預后,網膜蛋白和心臟代謝特性得到了改善〔25〕。因此,可以認為網膜蛋白由于體重減輕或肥胖相關因素的改善而增加。Madsen等〔33〕證明,每周進行8次劇烈運動和中度運動可促進卵巢切除大鼠的血清網膜蛋白增加。周琳等〔34〕實驗研究發現,有氧聯合抗阻訓練能夠改善糖尿病病癥,與此同時,血清omentin的水平呈顯著性升高,提示有氧運動改善糖尿病病癥可能與血清omentin水平升高有關。動物實驗證實,在對肥胖大鼠進行8 w游泳訓練后,大鼠體質量與血清omentin呈現出明顯的負相關,大鼠omentin水平呈現出明顯的下降趨勢〔35〕。Nikseresht等〔36〕也證實,NRT和AIT不同程度的促進omentin-1的分泌進而降低心臟代謝的危險因素。omentin幾乎參與了整個2型糖尿病發病及血管內皮病變的全過程,而有氧運動可以通過刺激omentin的分泌改善糖尿病血管并發癥。本實驗結果提示,omentin可能通過AMPK/eNOS通路來促進舒血管因子NO的分泌,TNF-α、JNK等炎性因子的激活得到抑制,抑制炎癥介質的產生及氧化應激反應,達到改善糖尿病血管內皮功能障礙的作用。