miR-155在老年皮膚鱗狀細胞癌中的表達及作用機制

張紅娟 陳巖松 黎暉 劉慧

(福建醫科大學附屬南平第一醫院 1皮膚科,福建 南平 353000;2病理科)

皮膚鱗狀細胞癌發病率位居皮膚惡性腫瘤的第2位,僅次于皮膚基底細胞癌,但轉移率和死亡率明顯偏高,男性多發于女性,主要發生于中老年人群,以60～79歲為發病高峰,多數患者同時伴發著色性干皮病〔1〕。皮膚鱗狀細胞癌的發生與進展是一個多基因共同參與的過程,探尋相關調控分子,對提高臨床診治水平具有重要意義〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA,能夠在轉錄水平上調控基因表達,參與惡性腫瘤的發展〔3〕。近年來研究發現,miR-155在甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高表達〔4〕,但在人皮膚鱗狀細胞癌中作用的研究仍十分少見。本研究旨在探討miR-155在皮膚鱗狀細胞癌中的表達特點及作用機制。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2020年3月至2021年7月福建醫科大學附屬南平第一醫院收治的老年皮膚鱗狀細胞癌患者42例。入選標準:年齡≥60歲,均通過手術切除并經病理檢查確診為皮膚鱗狀細胞癌。排除術前有放療、化療等抗腫瘤治療史。其中男25例,女17例;年齡61～78歲,平均(67.05±5.92)歲;分化程度:高分化20例,中分化12例,低分化10例;淋巴結轉移情況:轉移17例,未轉移25例。另收集20例正常皮膚組織為對照,男12例,女8例;年齡60～76歲,平均(65.97±6.40)歲。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究受試者自愿簽署知情同意書。

1.2材料與主要試劑 人皮膚鱗狀細胞癌細胞系SCL-1購于上海弘順生物有限公司。Trizol試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒均購于上海聯邁生物有限公司;DMEM培養基、胎牛血清購于武漢普諾賽科技有限公司;脂質體2000購于上海研拓生物有限公司;鼠抗人細胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體、鼠抗人細胞增殖因子(Ki-67)單克隆抗體、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體及相應的二抗均購于賽業生物科技有限公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測組織標本中miR-155表達水平 采集兩組清晨空腹靜脈血,Trizol試劑盒提取血清總RNA,紫外分光光度計檢測濃度,逆轉錄得到cDNA。miR-155和內參U6的引物序列由上海生工生物有限公司設計合成,miR-155正向引物:5′-CGGCTGGAGCCTGGCACCTG-3′,反向:5′-AGTCG GGCGACGATGTCGCTC-3′。U6正向引物:5′-GTGGGTCTTGTCGTTGACTT-3′,反向:5′-GAGGAAAGGTCGGTTGGC-3′。反應體系共20 μl,其中總RNA 2 μl、dT18 1 μl、正向和反向引物各1 μl、dNTP 1 μl、雙蒸餾水14 μl。反應設定條件:94 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃復性30 s,共40個循環,72 ℃延伸30 s。2-ΔΔCt計算miR-155表達水平。

1.4miR-155靶點預測 使用microRNA.org、miRMap、miRwalk 3個數據庫預測miR-155靶基因,采用韋恩分析法篩選出3個數據庫共同預測的miR-155靶基因〔5〕。KEGG富集分析miR-155靶基因的信號通路富集情況,通過基因功能注釋和查閱相關文獻〔5,6〕推測靶基因的潛在功能,確定miR-155的下游靶點。

1.5人皮膚鱗狀細胞癌細胞系SCL-1培養與轉染 使用含胎牛血清的DMEM完全培養基培養人皮膚鱗狀細胞癌細胞系SCL-1,置于37 ℃ 5%CO2培養箱中孵育,待細胞生長至90%融合時進行傳代。取對數生長期細胞接種于24孔板中,分為對照組(常規培養)、miR-155抑制陰性對照組(轉染miR-155 inhibitor control)、miR-155抑制組(轉染miR-155 inhibitor)、miR-155激動陰性對照組(轉染 miR-155 mimics control)、miR-155激動組(轉染 miR-155 mimics),轉染基因的設計合成由蘇州吉瑪基因有限公司完成,使用脂質體2000轉入人骨髓間充質干細胞。

1.6各組蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)及AKT下游潛在基因表達檢測 轉染后培養48 h,qRT-PCR檢測各組人骨髓間充質干細胞中PTEN、AKT、叉頭框蛋白(FOX)O1、結節硬化征(TSC)1、TSC2、糖原合酶激酶(GSK)3β、RAF1表達水平。引物序列由上海生工生物有限公司設計合成,PTEN正向引物:5′-AAGTGATGAGGCCACGAGA-3′,反向:5′-TGGTGTACCGCAAGGTCGT-3′;AKT正向引物:5′-TCGTGGTAGAGAAG GTCC-3′,反向:5′-CAGGACGACCGTTCTTACGA-3′;FOXO1正向引物:5′-TCGTGGTAGAGAAGGTCC-3′,反向:5′-CAGGACGACCGTTCTTAC-3′;TSC1正向引物:5′-AGTC-GTCATTGGTGTCAGTTG-3′,反向:5′-GTTGCCCGG-ACCAATGTTC-3′;TSC2正向引物:5′-TGATCGAATA-TGTATTAAGG-3′,反向:5′-TGGAGCCTGGGAC-GTGATC-3′;GSK3β正向引物:5′-GAAATAGAGCCGAGAACGCGT-3′,反向:5′-CACCTTGTCGACTCGGCACTT-3′;RAF1正向引物:5′-CTCCTCTCAATG-AACCAGCAAGT-3′,反向:5′-GATTTACTCGGACGC-TTTCGATGA-3′;內參GAPDH正向引物:5′-ACGGTACCTTAACGGTACCCACC-3′,反向:5′-CCACCTGGACTGGACGGCAGATG-3′。反應體系和反應條件同1.3。

1.7Western印跡檢測CyclinD1、Ki-67、Caspase-3蛋白表達水平 取對照組、miR-155抑制組、miR-155激動組培養基誘導培養21 d的人皮膚鱗狀細胞癌細胞系SCL-1,RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉法將目標蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下封閉40 min,滴加鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體,均為1∶500稀釋;兔抗人Caspase-3單克隆抗體,1∶800稀釋;鼠抗人GAPDH單克隆抗體,1∶2 000稀釋;4 ℃孵培育過夜,滴加相應的二抗,1∶2 000稀釋,電化學發光(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取灰度值。

1.8統計學分析 使用SPSS25.0統計學軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1不同組織中miR-155表達水平比較 皮膚鱗狀細胞癌組織中miR-155表達水平(4.08±0.51)高于正常皮膚組織(1.16±0.24),差異有統計學意義(t=19.425,P=0.000)。

2.2miR-155的潛在靶點預測 miRNA靶基因預測數據庫預測出靶基因21個,分別為Anxa7、Mapk6、Rap1a、Rab18、Scn1b、lgf2r、Sgk1、Rnf167、Kcnk2、Dmr1、Sv2a、PTEN、Ppara、Snx27、Tnfrsf12a、Ptk2b、Cltc、Cast、Stc25a20、Trak2、Btg1;對這些靶基因進行KEGG富集分析顯示,上述靶基因富集中于GnRH通路、趨化因子通路、cAMP通路等。通過基因功能注釋和查閱相關文獻推測PTEN基因可能是miR-155的潛在靶點。

2.3miR-155表達對PTEN及AKT/GSK3β通路表達的影響 對照組、miR-155抑制陰性對照組、miR-155激動陰性對照組PTEN、AKT、GSK3β差異無統計學意義(P>0.05);miR-155抑制組PTEN水平明顯低于miR-155抑制陰性對照組和對照組,AKT、GSK3β水平明顯高于miR-155抑制陰性對照組和對照組(P<0.01);miR-155激動組PTEN水平明顯高于miR-155激動陰性對照組和對照組,AKT、GSK3β水平明顯低于miR-155激動陰性對照組和對照組(P<0.01)。見表1。

表1 各組PTEN、AKT及AKT下游潛在基因表達水平比較

2.4miR-155對皮膚鱗狀細胞癌細胞中CyclinD1、Ki-67、Caspase-3表達的影響 皮膚鱗狀細胞誘導培養第21天,miR-155抑制組CyclinD1、Ki-67蛋白表達水平明顯低于對照組,Caspase-3蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.01);miR-155激動組CyclinD1、Ki-67蛋白表達水平明顯高于對照組,Caspase-3蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測各組皮膚鱗狀細胞癌細胞中CyclinD1、Ki-67、Caspase-3蛋白表達

表2 各組皮膚鱗狀細胞癌細胞中CyclinD1、Ki-67、Caspase-3蛋白表達水平比較

3 討 論

皮膚是人體與外界環境的主要屏障,能夠保護機體免受環境中有害因素的影響,包括致癌化學物質、乳頭狀瘤病毒、放射線等〔6〕。當長期暴露于上述有害因素時,會增加皮膚鱗狀細胞癌的發生風險。miRNAs在人體不同病變組織中表達存在差異且發揮調控作用〔7〕;近年來研究發現,miRNAs轉錄后靶向作用上皮組織中角質形成的相關基因,參與調控表皮上皮細胞的增生、分化、凋亡等過程〔8〕。與正常皮膚相比,鱗狀細胞癌中miR-21表達水平明顯提升,且miR-21原癌基因靶向作用于PTEN、GRHL3基因,激活PI3K/AKT信號傳導通路,誘導皮膚鱗狀細胞癌〔9〕。miR-206通過負調控絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因,抑制皮膚鱗狀細胞癌皮下腫瘤的生長〔10〕。不同miRNAs在不同類型的惡性腫瘤中表達存在差異,即使同一個miRNA在不同惡性腫瘤中表達也可能不相同。如miR-365在原發性乳腺癌和皮膚鱗狀細胞癌中高表達,而在原發性肝癌、非小細胞肺癌中低表達〔11〕。

miR-155是近年來研究發現的一種miRNA,在乳腺癌、結直腸癌、肺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中高表達,參與調控腫瘤細胞的增殖、分化、轉移及凋亡過程〔12,13〕;但在皮膚鱗狀細胞癌中作用的研究仍十分少見。本研究結果提示miR-155表達水平可能與皮膚鱗狀細胞癌的發生、發展呈正相關。但miR-155是否直接參與調控皮膚鱗狀細胞癌目前仍未明確。另外,本研究結果提示miR-155對皮膚鱗狀細胞癌細胞的調控是通過影響PTEN/AKT/GSK3β表達來實現。PTEN是AKT信號通路上的靶目標基因,PTEN高表達會抑制AKT基因活性,AKT下游基因GSK3β表達也隨之降低,加速皮膚鱗狀細胞癌病情發展。

CyclinD1是高度保守的細胞周期家族成員,主要參與調控G1至S期,CyclinD1高表達會促使細胞加速從G1到S期,進而促進細胞增殖〔14〕。Ki-67是能夠反映細胞增殖狀態的標志抗原,存在于細胞G1、S、G2、M期,半衰期短,能夠準確、敏感反映細胞增殖活性〔15〕。Caspase級聯反應參與細胞的凋亡過程,作為細胞凋亡的參與者和執行者,Caspase-3活化后能夠加速細胞凋亡〔16〕。本研究結果提示下調miR-155表達可通過PTEN/AKT/GSK3β信號通路抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖,促進細胞凋亡,達到疾病治療的目的,但具體分子機制仍需進一步深入研究。