基于TLR4/NF-κB研究苗藥黑骨藤對AGA大鼠Th17/Treg及相關細胞因子的影響

黨榮敏 蔣催蓉 謝洪書 羅康華 姚文琴

(黔南民族醫學高等?？茖W校 1病原生物學教研室,貴州 都勻 558000;2病理學教研室;3微生物學及免疫學檢驗教研室)

急性痛風性關節炎(AGA)是由于尿酸鹽沉積在關節囊、滑囊、軟骨、骨質和其他組織中而引起病損及炎性反應,其會發生引起沉積關節部位的劇烈疼痛,嚴重情況下會導致關節畸形,造成不可逆的關節殘疾,在一定程度上對人們生活質量造成不良影響〔1,2〕。目前臨床上治療此病以藥物治療為主,西藥具有療效不顯著、需長期服藥、不良反應較多等劣勢,故尋找一種療效顯著、副作用較小的藥物仍是目前學術研究的熱點〔3〕。傳統醫學在臨床各種疾病的療效彰顯優勢,臨床研究證實,傳統醫學不良反應少且具有“多靶點、多通路”的獨特優勢〔4〕。苗藥黑骨藤具有良好的抗類風濕性關節炎作用,其作用機制可能與調節免疫器官功能及促進炎細胞因子水平有關〔5〕。但目前鮮少苗藥黑骨藤在AGA中作用報道。本研究探究基于Toll樣受體(TLR)4/核轉錄因子(NF)-κB研究苗藥黑骨藤對AGA大鼠輔助性T細胞(Th)17/調節性T細胞(Treg)及相關細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物:選取90只SPF級雄性健康大鼠,由第三軍醫大學實驗動物中心提供,體質量224～249 g,平均(225.62±10.44)g,將大鼠放置室溫22～24 ℃,濕度40%～70%,12 h光照/12 h黑暗交替無病原菌干凈籠子中飼養,飲用的水和食物均經消毒,統一喂給標準飼料,允許自由活動,飼養1 w。主要試劑:秋水仙堿購自西雙版納版納藥業有限責任公司,國藥準字:H53021369,規格:0.5 mg;白細胞介素(IL)-1β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海廣銳生物科技有限公司(貨號:elisa2013-0424)、IL-6 ELISA試劑盒購于武漢益普生物科技有限公司(貨號:CK-E30646)、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒購于上海臻科生物科技有限公司(貨號:ZK-6601);TLR4抗體購于武漢菲恩生物科技有限公司(貨號:FNab08727);NF-κB抗體購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司(貨號:PL0403111)。

1.2建模及分組 在90只SPF級雄性健康大鼠中選取15只作為正常組,其余大鼠參照薛舒月等〔6〕研究建立急性痛風性關節炎模型,在大鼠踝關節外后方和沿著與脛骨成45 °夾角方向將含有0.2 ml MSU懸混液的5號注射器插入右踝關節腔并注入,輕揉拉伸關節,幫助藥物擴散至關節周圍各部位,建模成功標準:各組踝關節均出現明顯腫脹。建模成功后將大鼠隨機分為模型組、秋水仙堿組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各15只。

1.3給藥 藥物按照10倍于60 kg人提高總折算為大鼠等效劑量,通過查閱相關文獻及預實驗的結果,苗藥黑骨藤的劑量分別為:25、50、100 mg/kg,低、中、高劑量組分別給予25、50、100 mg/kg苗藥黑骨藤灌胃,秋水仙堿組使用0.1 mg/kg的秋水仙堿灌胃,正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃,每日均在上午9點灌胃給藥1次,持續給藥7 d。

1.4樣本采集 在第7天灌胃2 h后股動脈取血,分離血中單個核細胞進行Th17、Treg含量測定;同時分離血清及切取關節囊、分離關節滑膜組織,保存備用。

1.5Th17/Treg及相關細胞因子水平 采用美國BD公司Facs CantoⅡ型流式細胞儀測定Th17、Treg含量,計算Th17/Treg比值。采用ELISA測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平,實驗步驟按相關 ELISA試劑盒說明書操作。

1.6Western印跡檢測TLR4、NF-κB蛋白表達 將蛋白緩沖液加入各組組織中并采用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白進行定量檢測,隨后取10 μl蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜,隨后在其中加入適量一抗并封閉,過夜孵育環境為4 ℃,采用Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)對各組組織進行洗滌后加入適量二抗并孵育1 h,孵育環境為室溫,對各組組織進行洗膜并加入等體積化學發光液A液、B液與PAGE膜反應,曝光顯影,內參蛋白為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。

1.7統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1Th17/Treg及相關細胞因子水平比較 高、中、低劑量組、秋水仙堿組及模型組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于正常組,Treg明顯低于正常組(P<0.05)。高、中、低劑量組、秋水仙堿組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組,Treg明顯高于模型組(P<0.05)。高、中、低劑量組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于秋水仙堿組,Treg明顯高于秋水仙堿組(P<0.05)。高、中劑量組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于低劑量組,Treg明顯高于低劑量組(P<0.05)。高劑量組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于中劑量組,Treg明顯高于中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組Th17/Treg及相關細胞因子水平比較

2.2TLR4、NF-κB蛋白表達量比較 高、中、低劑量組、秋水仙堿組、模型組TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯高于正常組(P<0.05),高、中、低劑量組、秋水仙堿組TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯高于模型組(P<0.05),高、中、低劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯高于秋水仙堿組(P<0.05),高、中劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯低于低劑量組(P<0.05),高劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯低于中劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組TLR4、NF-κB蛋白表達量比較

3 討 論

AGA作為一種遷延性濕病時刻危害著人類健康,臨床上多采用秋水仙堿和糖皮質激素控制患者臨床癥狀,但不可避免會出現大量藥物不良反應,如胃腸道反應、腎功能不全、骨髓抑制、皮疹、脫發等,在一定程度上可緩解臨床癥狀,但復發率較高、不良反應較大,再加之部分患者依從性差、不能堅持服用,且到目前為止,暫無根治此病的藥物〔7～9〕。中醫在疾病治療方面積累較多經驗逐漸進入研究者的視野,且越來越多的研究發現中醫藥確實對AGA有一定療效。黑骨藤是貴州苗族地區常用藥物之一,是蘿摩科植物西南杠柳的根或全株,其味苦、辛、性溫、有小毒,具有活血消癰、祛風除濕的功效〔10,11〕。在楊婉珠等〔12〕研究中,黑骨藤醇提取物對急性心力衰竭大鼠具有一定的保護作用,機制可能與增強心肌超氧化酶活性,進而改善急性心力衰竭大叔體內氧化應激失衡及增強心臟泵血功能有關。既往研究顯示〔13〕,黑骨藤追風活絡膠囊中含有黑骨藤成分,針對西南地區高原風寒濕氣候所誘導的風濕、類風濕關節炎患者具有較好的治療效果,其中黑骨藤具有祛風除濕、活血通絡、消痹止痛的功能,還具有較好的抗炎效果,但具體臨床作用機制與治療靶點未有深入挖掘。在本研究中,苗藥黑骨藤在AGA治療中,療效顯著,可有效降低炎性因子水平,緩解炎癥反應。

眾多研究顯示〔14,15〕,AGA的發病關節局部伴隨一些信號通路的激活或抑制,TLR4/NF-κB是其中最重要的信號通路之一,該通路的激活、細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的大量產生與AGA的發病與炎癥表現密切相關。TLRs受體屬于模式識別受體家族,可識別病原相關分子模式,其中TLR4為該家族研究最多的分子之一。TLRs為Ⅰ型跨膜受體,當其活化后通過TLR結合域與髓樣分化分子結合并激活IL-1受體相關激酶,隨后結合TNF受體相關因子6活化轉化生長因子β活化激酶1,進而激活NK-κB〔16,17〕。NF-κB位于TLR4/NF-κB信號通路下游的重要節點,參與調節體內重要細胞因子、炎癥因子、黏附因子等的表達,若NF-κB被激活,可促進IL-1β、IL-6等炎性細胞因子表達,產生炎癥級聯反應〔18,19〕。IL-1β在炎癥反應中可促進并招募中性粒細胞、巨噬細胞,進而引起紅、腫、熱、痛等關節炎表現,同時釋放的炎性物質可刺激巨噬細胞產生更多的IL-1β,加劇炎癥反應〔20〕。有研究顯示〔21〕,IL-1β可激活破骨細胞使其分化,還可作用于神經元、觸發機體對炎癥所致疼痛的過度敏感;TNF-α可通過相關信號通路促使IL-1β、IL-6等細胞因子分泌及中性粒細胞出現吞噬活性并釋放氧自由基和蛋白水解酶,導致尿酸鹽沉積處出現充血、水腫、大量炎癥細胞浸潤且不斷加重。而研究發現〔22〕,AGA的發病過程中CD4+T細胞所參與機體免疫調節的Th具有重要的作用,其亞群失衡在痛風的發生和進展中具有重要作用。Th17、Treg細胞是CD4+T細胞在細胞因子的刺激下分化成的兩個Th亞型,Th17細胞可分泌促炎因子,誘導單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞分泌炎性因子和趨化因子,促進并加重炎癥反應的發生;Treg細胞是負相免疫調節細胞,通過釋放抑炎因子抑制機體過度免疫反應。本研究結果顯示,經藥物干預治療后AGA大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯降低,Th17/Treg失衡被調控,且苗藥黑骨藤作用優于秋水仙堿,呈劑量依賴,推測其作用機制可能與調節TLR4/NF-κB信號通路,促進Th17/Treg平衡,抑制關節組織炎癥相關。

綜上,苗藥黑骨藤可通過下調TLR4、NF-κB蛋白表達量,抑制TLR4/NF-κB信號通路,降低Th17/Treg及相關細胞因子水平,減輕炎癥反應,緩解急性痛風性關節炎疾病進展,起到治療作用。