分子靶向治療對直腸癌大鼠巨噬細胞極化及PPIA/GRP78的作用機制

孫銀平 劉奕明 俞劍偉 林承春

(福建醫科大學附屬龍巖第一醫院消化內科,福建 龍巖 364000)

直腸癌大體可分為潰瘍型、隆起型、浸潤型,多數直腸癌是腺瘤性息肉病變所致,雖然導致直腸癌發生的具體原因尚不明確,但與飲食(高脂、高蛋白)、遺傳因素、年齡、化學接觸等因素有關。近年來發現,相關因子的異常表達可參與腫瘤的發展。實體瘤中,由于腫塊的快速生長,產生了缺血缺氧的現象,致使營養供應不足,從而導致理葡萄糖調節蛋白(GRP)78水平升高,高表達GRP78可促進癌細胞的生長及血管新生。研究表明〔1〕,GRP78是內質網應激的標志,內質網應激與細胞自噬及凋亡關系密切,能誘導C/EB同源蛋白表達,并通過其表達調控細胞凋亡,參與結腸癌的生物行為。肽基脯氨酰順反異構酶(PPI)A可調節生物學行為。相關研究提示〔2〕,PPIA對肝癌細胞的凋亡具有一定促進作用,但目前關于PPIA對直腸癌的相關文獻較少,具體作用機制尚不明確。研究顯示〔3,4〕,腫瘤相關巨噬細胞參與腫瘤產生及發展。巨噬細胞可識別機體內有害物質及衰老細胞等,且在不同情況下,存在不同的表型。在腫瘤中一般分為M1和M2兩種類型。M1型具有抗炎、抗腫瘤作用;M2型發揮抑制腫瘤免疫應答作用。阿帕替尼是一種新型的小分子抗血管生成抑制劑,主要通過高度選擇性抑制血管內皮生長因子(VEGF)受體(VEGFR)-2酪氨酸激酶活性,阻斷VEGF與其受體結合后的信號轉導通路,從而強效抑制腫瘤血管生成,發揮抗腫瘤作用。研究發現〔5〕,阿帕替尼對于治療結直腸癌具有較好的治療效果及安全性,可延長患者的生存期,為化療失敗患者提供新希望。但阿帕替尼對直腸癌巨噬細胞極化及PPIA、GRP78水平的影響尚不明確,因此,本文研究分子靶向治療對直腸癌大鼠巨噬細胞極化及PPIA/GRP78的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康SD大鼠48只購自深圳子科生物公司,動物許可證號:SCXK(粵)2018-0026,6～8月齡,體質量220～300 g。常規飼養,溫度25.6 ℃左右,模仿12 h晝夜交替,大鼠自由進食、飲水2 w,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2實驗試劑 阿帕替尼(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司);植酸鈉(深圳樂芙生物公司);PPIA、GRP78一抗(北京百奧萊博生物公司);辣根過氧化物酶二抗(南京全隆生物公司);流式細胞儀(上海沫錦醫療器械公司);聚合酶鏈反應(PCR)儀(上海士森視覺科技公司,型號:ProFlex96)。

1.3模型建立 48只大鼠隨機分為健康組12只,常規飼養;剩余36只建立直腸癌模型。第1天腹腔注射偶氮甲烷(AOM)(10 mg/kg),2.5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)連續飲水1 w,間隔給予蒸餾水2 w,重復DSS/蒸餾水飲水2個循環,每天觀察腫瘤生長情況,當出現腫瘤結節時,則視為建模成功,具體見蘇木素-伊紅(HE)染色結果。建模成功后24 h:①腸癌組:12只直腸癌模型大鼠常規飼養;②治療組:給予12只直腸癌模型大鼠45 mg/kg阿帕替尼灌胃,1次/d,共2 w;③對照組:12只直腸癌模型大鼠給予1 g/kg植酸鈉灌胃,1次/d,所有大鼠干預2 w后處死。建模過程中,有3只大鼠死亡,最終健康組12只大鼠,腸癌組、治療組及對照組均為11只大鼠。

1.4檢測各組瘤重、抑瘤率 取各組大鼠,麻醉后處死,稱重,剝離瘤體,稱瘤重。抑瘤率:實驗結束后統計各組抑瘤率。抑瘤率=(腸癌組平均瘤重-治療組平均瘤重)/腸癌組平均瘤重×100%。

1.5HE染色觀察病理形態 取各組直腸組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡下觀察結直腸組織病理變化。

1.6免疫組化檢測CD86(M1型巨噬細胞標志)、CD206(M2型巨噬細胞標志)、VEGF表達 取各組直腸組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,脫蠟水化,過氧化氫(H2O2)失活,低火加熱1 min修復抗原加血清封閉,加一抗CD86、CD206(1∶200)、VEGF(1∶500),4 ℃過夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,加入二抗,最后應用二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑染色,直腸癌組織中的陽性信號為淡黃色至棕褐色,采用4級計分,無染色均為0分,染色細胞占比為0～5%;淺黃色染色為1分,染色細胞占比為6%～25%;棕黃色染色為2分,染色細胞占比為26%～49%;棕色染色為3分,染色細胞占比為50%～100%。

1.7流式細胞術檢測巨噬細胞表型 取各組大鼠直腸組織,剪碎、研磨,消化,經Percoll密度梯度離心分離得到直腸組織中的免疫細胞。將細胞與流式抗體共孵育30 min后,用PBS重懸上流式細胞儀檢測。所采用的流式抗體為CD86、CD206的流式抗體。

1.8反轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測PPIA、GRP78、VEGF mRNA水平 取各組直腸組織,碾磨勻漿,添加1 ml RNA提取試劑Trizol,12 000 r/min離心15 min;在上清液中加入異丙醇,混勻,12 000 r/min離心10 min;RNA為底部的白色沉淀,吸去液體,用75%乙醇1.5 ml洗滌白色沉淀;4 ℃下12 000 r/min離心5 min吸去上清液;沉淀干燥后,溶解RNA。將提取的RNA轉錄為cDNA,在PCR儀上保溫42 ℃ 60 min,之后保持70 ℃ 5 min使反轉錄酶滅活。反應條件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環。結束后做溶解曲線,在60 ℃ 95 ℃下做檢測,每30 s升溫1 ℃?；蛳鄬Ρ磉_量=2-△△Ct。引物序列:PPIA上游引物:5′-GCCAGGGTGGTGACTTTA-3′,下游:5′-AACTGGGAACCGTTTGTG-3′;GRP78上游引物:5′-GACATCAAGTTCTTGCCGTT-3′,下游:5′-CTCATAACATTTAGGCCAGC-3′;VEGF上游引物:5′-ACCATGGCAGAAGGAGGAG-3′,下游:5′-ACGCGGTCTGTGTTTTTGC-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.9Western印跡檢測PPIA、GRP78、VEGF水平 取各組直腸組織,RIPA裂解液裂解,離心。收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。取適量蛋白質,加入上樣緩沖液,95 ℃煮沸5 min,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后,將分離的蛋白條帶轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h之后加入PPIA、GRP78一抗,4 ℃孵育過夜。Tris鹽酸緩液吐溫(TBST)清洗,加入辣根過氧化物酶二抗,37 ℃孵育2 h,洗膜,電化學發光(ECL)避光顯影。ImageJ圖像軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.10統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、兩組間對比采用t檢驗。

2 結 果

2.1各組瘤重及抑瘤率比較 健康組無瘤重及抑瘤率,腸癌組瘤重顯著高于治療組與對照組(P<0.05),治療組與對照組瘤重與抑瘤率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組瘤重、抑瘤率、CD86、CD206、VEGF陽性率及CD86、CD206表達比較

2.2免疫組化檢測 與健康組相比,腸癌組、治療組及對照組CD86陽性率顯著降低,CD206陽性率顯著升高(P<0.05)。與腸癌組相比,治療組與對照組CD86陽性率顯著升高,CD206、VEGF陽性率顯著降低(P<0.05)。治療組與對照組CD86、CD206、VEGF陽性率相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

2.3流式細胞術檢測 與健康組相比,腸癌組、治療組及對照組CD86水平顯著降低,CD206水平顯著升高(P<0.05)。與腸癌組相比,治療組與對照組CD86水平顯著升高,CD206水平顯著降低(P<0.05)。治療組與對照組CD86、CD206水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組流式細胞儀檢測

2.4HE染色 健康組結直腸組織黏膜上皮完整,細胞結構正常,排列整齊。腸癌組結直腸組織黏膜上皮大量壞死,腸腔面有潰瘍形成,有大量炎性細胞浸潤,伴有血管增生,提示直腸癌模型建立成功。與腸癌組相比,治療組與對照組有所改善。見圖3。

圖3 各組結直腸(HE染色,×100)

2.5各組PPIA、GRP78、VEGF mRNA及蛋白水平比較 健康組直腸組織中PPIA、GRP78、VEGF mRNA及蛋白水平顯著低于腸癌組、治療組及對照組(P<0.05)。腸癌組直腸組織中PPIA、GRP78、VEGF mRNA及蛋白顯著高于治療組及對照組(P<0.05)。治療組與對照組直腸組織中PPIA、GRP78、VEGF mRNA及蛋白相比差異無統計學意義(P<0.05)。見表2、圖4。

圖4 Western印跡檢測PPIA、GRP78、VEGF蛋白表達水平

表2 各組PPIA、GRP78、VEGF mRNA及蛋白水平比較

3 討 論

在我國,直腸癌患者常見的發病年齡在40歲以上,男性直腸癌發病率高于女性,直腸癌威脅患者的生命健康,關于其治療至關重要〔6〕。

VEGF是一種選擇性的內皮細胞有絲分裂原,特異性作用于血管內皮細胞,參與惡性腫瘤的發生發展。研究表明〔7〕,VEGF可促進血管新生,加快腫瘤生長,促進腫瘤向遠處轉移。另有研究發現〔8〕,VEGF在直腸癌中水平與癌細胞的轉移呈正相關,是診療結腸癌的重要指標。分子血管靶向藥可顯著降低血管新生,阻滯腫瘤轉移等。研究提示〔9〕,阿帕替尼通過抑制VEGFR-2進而抑制VEGF及其受體通路,發揮抗血管生成作用。已有研究證實,阿帕替尼對肺癌〔10〕、胃癌〔11〕等多種腫瘤具有一定療效。植酸又名肌醇六磷酸,是一種天然有機化合物,目前已有研究證實〔12〕,其對于治療直腸癌已較為成熟,本文運用植酸作為阿帕替尼的藥物對照,結果提示,阿帕替尼可通過抑制VEGFR-2表達進而下調VEGF水平抑制腫瘤發展。相關研究表明〔13〕,阿帕替尼能夠對VEGFR進行有效抑制,在晚期轉移性結直腸癌的臨床治療中具有顯著療效,且其耐受性較高,能有效延長患者總生存期。潘妍等〔14〕在對胃癌患者的研究中提出,阿帕替尼通過降低VEGF、白細胞介素(IL)-2R水平,改善患者病情嚴重情況,提高患者總生存期。本研究與上述研究結果相似。

巨噬細胞與腫瘤的產生與發展聯系密切,M1型巨噬細胞具有殺菌、補體介導的吞噬及抑制腫瘤發展的作用;M2型具有促進腫瘤發展的作用。本研究提示,阿帕替尼具有促進巨噬細胞向M1極化,并抑制其向M2極化的作用。研究表明〔15〕,在直腸癌中,巨噬細胞與腫瘤血管形成呈正相關,巨噬細胞通過促進VEGF表達促進腫瘤血管形成。由此,本研究推測阿帕替尼可能是通過抑制VEGF水平,抑制巨噬細胞向M2型極化,并促進其向M1型極化,從而阻滯腫瘤發展。本研究與上述研究結果相似。

PPIA具有調節細胞內信號、生物學行為的作用,參與腫瘤的產生及發展。報道顯示〔16〕,高表達PPIA可促進癌細胞增殖,并參與癌細胞轉移。GRP78在多種腫瘤中高表達,并促進癌細胞的增殖、血管生成等。研究表明,高表達GRP78存在于多種腫瘤中,包括乳腺癌、肺癌等〔17～19〕。彭婭等〔20〕在對結直腸癌的研究中發現,GRP78與PPIA呈正相關,在結直腸癌中均表達升高,在經過抑制其水平后可顯著改善患者預后。目前,關于阿帕替尼對GRP78、PPIA的作用機制尚無相關研究,無法論證本文研究觀點,在今后實驗中,應增加、完善實驗內容,論證本文研究結果。楊宇菲〔21〕通過體外實驗研究表明,分泌型GRP78在微環境中可促腫瘤相關血管生成,且與VEGF呈正相關,且采用丹酚酸A干預后可降低VEGF基因活性進一步抑制GRP78蛋白水平,進而抑制瘤體生長。因此,本文推測阿帕替尼可能通過抑制VEGF水平降低GRP78、PPIA表達,進而抑制直腸癌發展。