干擾LINC00334對地塞米松處理的BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影響

田中青 李金洲 曹丕健

(1菏澤市中醫醫院骨科,山東 菏澤 274000;2菏澤市巨野縣人民醫院骨科;3菏澤市牡丹人民醫院骨科)

骨質疏松是一種骨量減少,微結構退化和脆性骨折的疾病,好發于老年人和絕經后婦女;促進骨形成是預防和治療骨質疏松的方式之一〔1,2〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是骨髓中具有較強的增殖能力和多向分化的潛能干細胞,分化失衡是引發骨質疏松的關鍵,促進其向成骨方向分化可防治骨質疏松;因此,尋找決定BMSCs分化方向的關鍵因子,可為骨質疏松的治療提供新思路〔3〕。研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)能調控成骨細胞、破骨細胞和BMSCs進而影響骨代謝進程,lncRNA表達失調與關節炎、骨質疏松和骨癌等多種骨疾病密切相關,有望作為預測骨疾病的生物標志物〔4〕。研究報道LINC00334在絕經后骨質疏松腎陰虛證中上調表達,其可能參與絕經后骨質疏松腎陰虛證的發生發展過程〔5〕。而LINC00334對BMSCs增殖、凋亡及成骨分化的影響尚不清楚。

研究報道ras同源家族(Rho)A/Rho激酶(ROCK)信號通路在骨質疏松BMSCs中表達降低,可能是骨質疏松發病的重要原因之一〔6〕。激活RhoA/ROCK信號通路可促進成骨分化和BMSCs增殖〔7〕。地塞米松(Dex)是糖皮質類激素,研究顯示較低濃度的Dex抑制BMSCs增殖及成骨分化,從而導致骨質疏松的發生〔8〕。本實驗用Dex處理BMSCs,研究LINC00334對Dex處理BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影響及其可能的作用機制是否與RhoA/ROCK信號通路有關。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠BMSCs購自上海博湖生物科技有限公司;α-MEM培養基、青鏈霉素、Dex購自美國Sigma公司;RhoA/ROCK信號通路抑制劑Y27632購自深圳欣博盛生物科技有限公司;Trizol試劑購自上海酶研生物科技有限公司;SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自武漢科昊佳生物科技有限公司;四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自上海谷研實業有限公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自大連美侖生物技術公司。

1.2細胞處理與分組 BMSCs細胞用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的α-MEM培養基培養,用10-6mol/L Dex處理BMSCs作為骨質疏松模型組,正常培養的細胞作為對照組;將si-NC、si-LINC00334轉染至BMSCs后用10-6mol/L Dex處理,記為模型+si-NC組、模型+si-LINC00334組;將si-LINC00334轉染至BMSCs后用10-6mol/L Dex和RhoA/ROCK信號通路抑制劑Y27632處理,記為模型+si-LINC00334+抑制劑組。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LINC00334、骨橋蛋白(OPN)mRNA、Run相關基因(Runx)2 mRNA、RhoA mRNA和ROCK mRNA表達水平 收集細胞提取總RNA,合成cDNA,按照試劑盒說明進行PCR,相對表達量用2-△△Ct法計算。以GAPDH為內參,LINC00334上游引物:5′-CGTGGGTTCTCCTTTGAGAG-3′,下游:5′-GGAAGCCCA-ATACATCCAAA-3′;OPN上游引物:5′-ACCCTTCCAAGTAAGTCC-3′,下游:5′-TGATGTCCTCGTCTGTAG-3′;Runx2上游引物:5′-CCGGTCTCCTTCCA-GGAT-3′,下游:5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′;RhoA上游引物:5′-TGATGGCTATTATGGACG-3′,下游:5′-GGAAGGCACAAATGAGAT-3′;ROCK上游引物:5′-CTGCGGGTACGAAGGTATCG-3′,下游:5′-AGCATCCAATCCATCCAGCA-3′;GAPDH上游引物:5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′,下游:5′-CTCCACGAC-GTACTCAGCG-3′。

1.4MTT檢測細胞增殖抑制率 收集培養48 h的各組細胞,按試劑盒說明進行,每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl,于培養箱中繼續孵育4 h后棄去上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,振蕩反應10 min使沉淀溶解,用酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=1-OD實驗組值/OD空白對照組值×100%。

1.5克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 各組細胞消化后接種于6孔板,每孔100個細胞,培養2 w出現肉眼可見克隆時終止培養,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍,甲醇固定15 min,吉姆薩染色30 min,然后計數>50個細胞的集落。

1.6Western印跡檢測Ki67、裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)3、caspase3前體(Pro-caspase3)蛋白表達提取總蛋白,BCA試劑盒定量后進行電泳,轉膜、封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜,然后再加入二抗室溫孵育2 h,最后加入電化學發光液(ECL)顯影,檢測蛋白條帶灰度值,計算蛋白相對表達水平。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養48 h的各組細胞,用預冷的PBS漂洗2次,加入500 μl的結合緩沖液重懸,加入10 μl的Annexin V-FITC,再加入5 μl的PI,混勻后避光孵育10 min;然后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs增殖的影響 與對照組相比,模型組和模型+si-NC組LINC00334表達水平明顯升高(t=41.590、41.723,P<0.05),細胞增殖抑制率明顯升高(t=46.538、46.867,P<0.05),克隆形成數明顯減少(t=25.899、25.756,P<0.05),Ki67表達水平明顯降低(t=26.112、26.112,P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組LINC00334表達水平顯著降低(t=27.550、27.683,P<0.05),細胞增殖抑制率顯著降低(t=26.793、27.123,P<0.05),克隆形成數明顯升高(t=14.676、14.533,P<0.05),Ki67表達水平明顯升高(t=17.234、17.234,P<0.05),見表1、圖1。

1～4:對照組,模型組,模型+si-NC組,模型+si-LINC00334組,圖3同圖1 干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs中Ki67蛋白表達的影響

表1 干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs增殖的影響

2.2干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs凋亡的影響與對照組相比,模型組和模型+si-NC組細胞凋亡率明顯升高(t=40.498、40.525,均P<0.05),Cleaved-caspase3表達水平明顯升高(t=18.783、18.783,均P<0.05),Pro-caspase3表達水平明顯降低(t=23.515、23.515,均P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組細胞凋亡率明顯降低(t=21.424、21.451,均P<0.05),Cleaved-caspase3表達水平明顯降低(t=17.709、17.709,均P<0.05),Pro-caspase3表達水平明顯升高(t=20.785、20.785,均P<0.05),見表2、圖2、圖3。

圖2 干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs凋亡率的影響

1～4:對照組、模型組、模型+si-NC組、模型+si-LINC00334組圖3 干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs中caspase3蛋白表達的影響

表2 干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs凋亡、OPN、Runx2 mRNA及RhoA/ROCK信號通路的影響

2.3干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs中OPN、Runx2 mRNA的影響 與對照組相比,模型組和模型+si-NC組OPN和Runx2 mRNA表達水平明顯降低(t=13.175、13.760、18.142、18.520,均P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組OPN和Runx2 mRNA表達水平明顯升高(t=8.490、9.076、10.961、11.339,均P<0.05),見表2。

2.4干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs中RhoA/ROCK信號通路的影響 與對照組相比,模型組和模型+si-NC組RhoA和ROCK mRNA表達水平明顯降低(t=26.944、26.595、20.502、19.932,均P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組RhoA mRNA和ROCK mRNA表達水平明顯升高(t=19.246、18.896、15.376、14.807,均P<0.05),見表2。

2.5RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs增殖凋亡的影響 與模型+si-LINC00334組相比,模型+si-LINC00334+抑制劑組細胞增殖抑制率明顯升高,克隆形成數明顯減少,Ki67表達水平明顯降低,細胞凋亡率明顯升高,Cleaved-caspase3表達水平明顯升高,Pro-caspase3表達水平明顯降低,OPN和Runx2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01,P<0.001),見表3、圖4、圖5。

圖4 RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs凋亡率的影響

1,2:模型+si-LINC00334組,模型+si-LINC00334+抑制劑組圖5 RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs中Ki67和caspase3蛋白表達的影響

表3 RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對Dex處理的BMSCs增殖凋亡的影響

3 討 論

BMSCs的分化失衡是引發骨質疏松的重要因素之一。Dex是常用的凋亡誘導劑,研究發現10-6mol/L的Dex抑制BMSCs增殖〔9〕。本實驗用結果顯示,10-6mol/L的Dex可抑制BMSCs增殖和成骨分化,誘導細胞凋亡,表明模型建立成功。有研究表明lncRNA參與BMSCs的成骨分化和成脂分化〔10〕。如lncRNA AK045490沉默可通過β-catenin/ T細胞因子(TCF)1/Runx2信號軸促進成骨細胞分化和骨形成〔11〕。抑制lncRNA HOTAIR可促進大鼠BMSCs的成骨細胞分化〔12〕。本實驗結果提示,LINC00334或可作為骨質疏松癥中的生物標志物。OPN、Runx2是成骨分化關鍵因子,其高表達促進成骨分化〔13,14〕。本實驗結果表明,干擾LINC00334可促進BMSCs增殖和成骨分化,抑制Dex處理的BMSCs凋亡。但LINC00334影響BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的機制尚不清楚。研究表明RhoA/ROCK信號通路可能通過介導細胞骨架變形來促進人間充質干細胞的成骨分化〔15〕。二甲基草酰甘氨酸通過Rho/ROCK信號促進BMSCs成骨〔16〕。本實驗結果表明,干擾LINC00334可能通過調控RhoA/ROCK信號通路促進BMSCs增殖和成骨分化,抑制Dex誘導的BMSCs凋亡。

成骨細胞功能衰減,骨形成不足,最終導致骨量丟失是導致骨質疏松產生的重要原因,而成骨不足與BMSCs分化方向密切相關〔17〕。因此,促進BMSCs向成骨方向分化是防治骨質疏松的重要途徑之一。本實驗的創新在于LINC00334是首次在BMSCs增殖、凋亡和成骨分化等方面的研究,且表明了其機制與RhoA/ROCK信號通路可能有關。盡管本實驗證明了干擾LINC00334可能通過調控RhoA/ROCK信號通路促進BMSCs增殖和成骨分化,抑制Dex誘導的BMSCs凋亡。但本實驗主要在細胞中進行的研究,其是否在體內起同樣作用還有待進一步的研究。