水溫和余氯對擬穴青蟹幼蟹的急性毒性研究

陳 琳,滕爽爽,陸 振,肖國強,蔡景波

( 1. 浙江省海洋水產養殖研究所,浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室,溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室,浙江 溫州 325005;2. 浙江海洋大學,浙江 舟山 316022 )

濱海核電廠通常采用海水作為直流冷卻水,通常采用定時向循環冷卻水中通氯氣[1-2]來解決生物阻塞問題。冷卻水排入受納海域,使海洋生物受到2～12 ℃熱沖擊和余氯的雙重脅迫。升溫和余氯直接或間接地影響到近海和河口區的水產資源及養殖業[3-4]。三門灣是多種魚、蝦、貝、蟹的天然繁殖場和養殖基地,更有“中國青蟹之鄉”的美稱,2019年浙江年產青蟹27 595 t,三門灣年產青蟹約占浙江的50%[5]。三門灣核電站一期工程2臺核電機組分別于2013、2014年全部建成投入商業運行[6],三門灣核電站運營后,筆者對鄰近海域中余氯污染狀況進行了調查,結果顯示,游離余氯質量濃度為0.01～0.18 mg/L,化合余氯質量濃度為0.01～0.02 mg/L,余氯在海水中形態主要為游離態。

自20世紀60年代以來,國外研究者就對余氯的生態效應開展了大量研究[7-9]。我國自上世紀80年代以來也開展了相關研究[10-12]。Rodrigues Macêdo等[7]研究了次氯酸鈣活性氯對三角渦蟲(Dugesiajaponica)的生態毒理學效應,指出96 h半致死質量濃度為3.16 mg/L,亞致死毒性表現為進食和運動明顯減少,生殖和生育能力受損;李毅等[12]研究了模擬夏季溫排水對福寧灣常見海洋生物的熱耐受性的影響,指出三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的 24 h高起始致死溫度為38.2 ℃;吳楊平等[13]研究了余氯對大竹蟶(Solengrandis)稚貝的毒性及半致死質量濃度,指出三氯異氰尿酸(含50%有效氯)對大竹蟶稚貝24 h半致死質量濃度為12.21 mg/L,安全質量濃度為1.22 mg/L;朱英[14]研究了次氯酸鈉對稀有鯽(Gobiocyprisrarus)的毒性影響,指出次氯酸鈉消毒劑(有效氯含量1.5%)對稀有鯽急性毒性的96 h半致死質量濃度為25.26 mg/L,對稀有鯽幼體生長的抑制效應質量濃度為15.72 mg/L;張璐等[15]研究了氯和氯胺對橈足類浮游動物滅活效能及機理,指出氯主要通過蛋白質外泄對浮游動物致毒,游離氯對橈足類浮游動物的滅活作用優于化合氯;葉利蘭等[16]指出,含氯制劑大量使用不僅會對單一水生物種造成影響,對水生態系統的群落結構和生態演替也會產生影響,進而影響水生態系統中的物質循環,最終破壞水生態系統的平衡。

擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)屬于軟甲綱十足目梭子蟹科青蟹屬,是三門灣海區重要的經濟物種之一。擬穴青蟹在幼蟹期遷移能力較弱,很容易受到污染物的影響[12],筆者以三門灣主要經濟養殖動物擬穴青蟹的早期幼蟹為試驗對象,根據三門灣核電站溫排水前期余氯污染狀況調查結果及查閱相關資料,設置溫度和余氯質量濃度,通過室內模擬培養,分析溫度、余氯及兩種因子交互作用對幼蟹存活率的影響,以期為三門灣核電站海水中余氯污染對該海域生物和生態環境的影響提供基礎資料,同時為制訂沿海電廠溫排水排放標準提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與暫養

試驗用擬穴青蟹幼蟹體質量(138±20) mg,收集于浙江省臺州市三門縣三門灣海區,采苗海區水溫25 ℃,未受到溫升和余氯脅迫。挑選四肢健全、活力良好的健康幼蟹,用海水仔細沖洗其表面附著物后,放入水箱中暫養5 d,暫養水溫(25 ± 0.5) ℃,鹽度22.5 ± 0.1。暫養期間充氣并投喂適量的鹵蟲(Artemia),每日定時換水,使其處于自然生活狀態。

1.2 試驗試劑

游離有效氯的制備:取市售次氯酸鈉溶液(分析純),用蒸餾水稀釋100倍,游離余氯質量濃度約1.5 mg/mL,儲存于小口棕色瓶中備用。

化合有效氯的制備:取市售氨水溶液(含氨量25%～28%,化學純)和市售次氯酸鈉溶液(分析純),氨含量約240 mg/mL,氯含量約150 mg/mL。按氨氯質量比3∶1進行反應,取1 mL次氯酸鈉溶液緩慢滴入208 μL氨水溶液中,均勻晃動10 min充分混勻,后定容至10 mL,所得化合有效氯制備液含量約15 mg/mL,儲存于小口棕色瓶中備用。

以上備用液皆臨用時配制。

試驗于浙江省海洋水產養殖研究所清江基地進行。試驗用海水為經24 h沉淀和砂濾后的樂清灣海域天然海水。經游離性余氯比色測定法檢測,海水本底不含游離氯和化合氯。

1.3 試驗設計

25 ℃是三門灣海域擬穴青蟹幼蟹大量出現季節的水溫,也是幼蟹生長的最適水溫,核電站溫排水普遍溫升情況為2～12 ℃[12,17-19],三門灣核電站排水溫較排水口自然溫度高7 ℃[20],為使試驗設計更科學嚴謹,采取在25 ℃基礎上,溫度提升5 ℃和10 ℃,來設計本試驗溫度梯度。試驗以25 ℃為對照組,以30 ℃和35 ℃為溫升組,共設置3個溫度梯度。根據三門灣海區余氯調查報告和預試驗結果,設置6個初始游離余氯質量濃度梯度(0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/L),6個初始化合余氯質量濃度梯度(加氨對照組1.575×10-3mg/L NH4OH[1]、30.0、36.0、42.0、48.0、54.0 mg/L)。通過3×12的正交試驗研究溫度和游離余氯、溫度和化合余氯共同脅迫于幼蟹的急性毒性效應。每一個水溫條件下的余氯質量濃度梯度均設置3個平行,每個平行投放20只幼蟹,即每個質量濃度組共有60只幼蟹。所用容器為108個500 mL燒杯,試驗處理96 h,其間充氣活水,每日換水1次,投喂鹵蟲1次,并于換水后重新添加相應的游離余氯、化合余氯試劑。在試驗中每6 h觀察記錄幼蟹的活動情況、中毒癥狀和死亡情況,及時撈出死亡個體。按照文獻[21]的方法,用玻璃棒觸及頭部和附肢無任何反應作為死亡的判別標準。

1.4 余氯測定方法

采用法國PONSEL便攜式水質分析儀(Mul-ty8302)及其配套試劑測定海水中余氯的含量(國家環境保護標準HJ 586—2010,游離性余氯比色測定法,量程0.1～6.0 mg/L)。

1.5 數據分析

用概率單元法[22]計算不同溫度條件下游離余氯和化合余氯96 h的半致死質量濃度(LC50)及95%置信區間,參照文獻[10]的方法計算對應安全質量濃度,安全質量濃度(SC)計算公式為:SC=96 h LC50× f,f值取0.1。數據以平均值±標準差表示,當方差齊性時采用Tukey進行多重比較,當方差不齊時采用Dunnett′s T3進行多重比較,分析各組死亡率是否具有顯著性差異,當P<0.05時統計具有顯著性差異;以單因素方差分析檢驗相同溫度下余氯質量濃度對幼蟹死亡率的顯著性差異,以雙因素方差分析(SPSS 22.0)檢驗溫度和余氯質量濃度對幼蟹死亡率的顯著性差異,P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 余氯質量濃度日變化

余氯質量濃度日變化見圖1。初始質量濃度為5.0 mg/L的游離余氯質量濃度日變化為0.76～5.00 mg/L,初始質量濃度為6.0 mg/L的游離余氯質量濃度日變化為0.91～6.00 mg/L,初始質量濃度為7.0 mg/L的游離余氯質量濃度日變化為1.88～7.00 mg/L,初始質量濃度為8.0 mg/L的游離余氯質量濃度日變化為2.68～8.00 mg/L,初始質量濃度為9.0 mg/L的游離余氯質量濃度日變化為3.32～9.00 mg/L。初始質量濃度為30.0 mg/L的化合余氯質量濃度日變化為21.5～30.0 mg/L,初始質量濃度為36.0 mg/L的化合余氯質量濃度日變化為27.1～36.0 mg/L,初始質量濃度為42.0 mg/L的化合余氯質量濃度日變化為33.6～42.0 mg/L,初始質量濃度為48.0 mg/L的化合余氯質量濃度日變化為41.5～48.0 mg/L,初始質量濃度為54.0 mg/L的化合余氯質量濃度日變化為45.0～54.0 mg/L。

圖1 余氯日變化曲線Fig. 1 Diurnal variation curve of residual chlorine

2.2 溫度對幼蟹的影響

在單一的溫度脅迫96 h急性毒性試驗中,對照組海水(25 ℃)和溫升組海水(30 ℃和35 ℃)條件下,幼蟹的96 h累積平均死亡率分別為(5.0±5.0)%、(3.3±2.9)%和(5.0±0)%,單因子方差分析結果表明,96 h內不同溫度試驗條件對幼蟹的死亡率無顯著性影響(P>0.05)(表1)。

表1 不同溫度條件對擬穴青蟹幼蟹死亡率的影響

2.3 余氯對幼蟹的急性毒性

在25 ℃時,游離余氯和化合余氯對幼蟹的急性毒性死亡結果見圖2、圖3。當幼蟹暴露于游離余氯或化合余氯不同時間(24、48、72、96 h)后,幼蟹的死亡率與余氯質量濃度表現出顯著的劑量-效應關系,即在相同的暴露時間下幼蟹的死亡率隨游離余氯質量濃度、化合余氯質量濃度的升高而顯著上升。而且游離余氯和化合余氯對幼蟹的毒性作用也與暴露時長呈顯著正相關,在相同質量濃度下,游離余氯和化合余氯的毒性作用隨暴露時間的增加而增強。

圖2 25 ℃下游離余氯對擬穴青蟹幼蟹死亡率的影響Fig. 2 The influence of free residual chlorine on the mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain at 25℃

圖3 25 ℃下化合余氯對擬穴青蟹幼蟹死亡率的影響Fig. 3 The influence of combined residual chlorine on the mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain at 25 ℃

2.4 溫度和余氯耦合對幼蟹的急性毒性

在不同溫度條件下游離余氯、化合余氯對擬穴青蟹幼蟹的96 h死亡率和96 h半致死質量濃度影響見圖4、圖5、表2。與對照組(25 ℃)相比,各溫升試驗組游離余氯或化合余氯對幼蟹的急性毒性顯著增強,且隨著溫度的升高呈現出遞增趨勢。游離余氯和化合余氯在35 ℃時表現對幼蟹的最強毒性,96 h半致死質量濃度分別為4.455 mg/L和27.290 mg/L,明顯高于其在25 ℃和30 ℃時對幼蟹的毒性(游離余氯在溫度為25 ℃和30 ℃時的96 h半致死質量濃度分別為5.437 mg/L和4.854 mg/L,化合余氯在溫度為25 ℃和30 ℃時的96 h半致死質量濃度分別為32.943 mg/L、29.415 mg/L)。隨著溫度的升高,游離余氯、化合余氯對幼蟹的急性毒性分別增加了近1.22、1.20倍,幼蟹在溫度高時表現出對更低劑量的余氯敏感?；嫌嗦葘τ仔返?6 h半致死質量濃度約為游離余氯的6倍。

圖4 溫度和游離余氯脅迫下擬穴青蟹幼蟹96 h死亡率Fig. 4 Influence of temperature and free residual chlorine on 96 h mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain

圖5 溫度和化合余氯脅迫下擬穴青蟹幼蟹96 h死亡率Fig. 5 Influence of temperature and combined residual chlorine on 96 h mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain

表2 各溫度條件下余氯對擬穴青蟹幼蟹的半致死質量濃度及安全質量濃度

對不同溫度條件下不同初始游離余氯質量濃度和初始化合余氯質量濃度擬穴青蟹幼蟹死亡率進行雙因素方差分析見表3。結果顯示,溫度與游離余氯對幼蟹死亡率存在交互作用(P<0.05)、溫度與化合余氯對幼蟹死亡率不存在交互作用(P>0.05)。

表3 雙因素方差分析結果

2.5 幼蟹死亡率與溫度、余氯質量濃度的關系

25 ℃時,每提升單位初始質量濃度游離余氯造成死亡率增加8.57%,每提升單位初始質量濃度化合余氯造成死亡率增加1.43%;30 ℃時,每提升單位初始質量濃度游離余氯造成死亡率增加11.67%,每提升單位初始質量濃度化合余氯造成死亡率增加1.54%;35 ℃時,每提升單位初始質量濃度游離余氯造成死亡率增加11.73%,每提升單位初始質量濃度化合余氯造成死亡率增加1.70%(圖6、圖7)。以每提升單位初始質量濃度游離余氯或單位初始質量濃度化合余氯造成的96 h死亡率增加值與溫度做線性回歸分析,每1 ℃溫升和1.0 mg/L游離余氯增加導致死亡率增加0.316%,每1 ℃溫升和1.0 mg/L化合余氯增加導致死亡率增加0.027%。游離余氯和溫升耦合導致的幼蟹死亡率提高量為化合余氯的11.7倍。

圖6 不同溫度下96 h死亡率與初始游離余氯質量濃度線性回歸分析Fig. 6 The linear regression analysis of 96 h mortality and initial free residual chlorine concentration at different temperatures

3 討 論

3.1 溫度對幼蟹存活的影響

適溫范圍內,溫度升高能促進蟹類的生長發育、繁殖代謝以及生理生化功能,但溫度過高會對蟹類存活產生影響。將擬穴青蟹從25 ℃開始逐級升溫(梯度為5 ℃),在30、35、40 ℃時擬穴青蟹未死亡,最后移入43 ℃水體中,忍受49 min后死亡;未經過馴化的擬穴青蟹在38 ℃忍受10 min后死亡[23]。黃海濤[4]研究了溫度、鹽度、溶解氧、氨氮、亞硝態氮對擬穴青蟹蛻殼的影響,結果表明,擬穴青蟹存活溫度為15～35 ℃,蛻殼溫度為20～35 ℃,蛻殼的適宜溫度為25～35 ℃;黃良民等[23]研究了急溫升對10種甲殼動物存活率的影響,結果表明,擬穴青蟹適溫范圍較廣,在15～33℃水體中均能正?；顒?當移入35 ℃水體中,2 min后出現不適癥狀,10 min后活動逐漸正常。本試驗為模擬溫排水急溫升試驗,試驗對象未經過馴化,所設置的溫度梯度對擬穴青蟹幼蟹的存活率無顯著性差異(P>0.05),應是試驗所設置的溫度梯度尚在擬穴青蟹幼蟹的適溫范圍內,這說明三門灣核電站海區中僅溫升條件不足以造成擬穴青蟹幼蟹死亡率明顯提升。

3.2 余氯對幼蟹的急性毒性

余氯對水生動物的鰓有損傷作用,使得鰓組織發生病變,如組織增生、上皮組織脫離、鰓中積累大量黏液、生成動脈瘤,從而影響并阻礙鰓與水中溶解氧的交換[11,24]。余氯也可通過蟹鰓組織滲入血淋巴中,由于余氯氧化性較強,它會把血淋巴中能攜帶氧的還原性血藍蛋白氧化成不能攜帶氧的二價銅血藍蛋白,還可能抑制二價銅血藍蛋白還原性酶的活性,從而導致血淋巴運載氧的能力下降[25-26]。Valarmathi等[27]發現,余氯會抑制相手蟹(Sesarmaquadratum)的耗氧率,這也證實了上述說法。

25 ℃是擬穴青蟹繁殖季節時三門灣核電站溫排水附近海區的平均水溫。在25 ℃情況下,游離余氯和化合余氯對擬穴青蟹幼蟹的24 h半致死質量濃度分別為9.62、53.57 mg/L,化合余氯對幼蟹的24 h半致死質量濃度是游離余氯的5.6倍;48 h半致死質量濃度分別為7.93、45.76 mg/L,化合余氯對幼蟹的48 h半致死質量濃度是游離余氯的5.8倍;96 h半致死質量濃度分別為5.44、32.94 mg/L,化合余氯對幼蟹的96 h半致死質量濃度是游離余氯的6.1倍。余氯對不同物種的急性毒性作用具有很大的差異性,例如:游離余氯對平鯛(Rhabdosargussarba)、黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)的48 h半致死質量濃度分別為0.19 mg/L和0.18 mg/L,化合余氯對平鯛、黑鯛的48 h 半致死質量濃度分別為0.56 mg/L和0.60 mg/L[1],游離余氯對大竹蟶稚貝24 h半致死質量濃度為12.21 mg/L,對中華水蚤(Calanussinicus)30 min半致死質量濃度為4.89 mg/L,對蒙古裸腹溞(Moinamongolica)30 min半致死質量濃度為3.92 mg/L[13,28]。擬穴青蟹幼蟹對余氯的耐受性不同于魚類和貝類,這可能源于生物生存環境的溫度、溶解氧、水層、大氣壓、光照等因子不同所致或者可能與不同物種自身解毒能力、耐受程度和保護功能有關[29]。

游離余氯和化合余氯對水生動物毒性作用的相對強弱根據物種而各有不同。何琴燕等[30]研究認為,對于浮游動物和浮游植物,化合余氯的毒性要比游離余氯強。Brungs[31]認為,魚類中游離余氯和化合余氯的毒性并無明顯差異。但也有很多研究表明,游離余氯的毒性明顯強于化合余氯,如Brooks等[2]對幾種魚分別進行短時間浸毒(15、30 min)和間歇性氯沖擊(4×30 min,每隔6 h 1次),結果發現,游離余氯的毒性比化合余氯大3～4倍。Heath[8]模擬電廠氯處理方式,對幾種淡水魚進行3×45 min(每隔8 h 1次)的間歇性氯沖擊,結果顯示,游離余氯的毒性是化合余氯的3～14倍。本試驗結果顯示,游離余氯毒性約為化合余氯毒性的6倍。不同海域,余氯的存在形態不同,大亞灣海域余氯在海水中形態主要為化合態[32],而三門灣海域余氯在海水中的形態主要是游離態,因此,評價溫排水中的余氯對水生環境及水生生物的影響時,應考慮不同海域余氯的主要形態和不同形態余氯的毒性差異。

3.3 溫度升高和余氯耦合對幼蟹的急性毒性

4 結 論

在三門灣海區溫度梯度內(25～35 ℃),96 h溫度脅迫對擬穴青蟹幼蟹的存活率無顯著影響(P>0.05)。溫度和余氯耦合下,溫度升高同時增強了游離余氯和化合余氯對擬穴青蟹幼蟹的急性毒性,幼蟹在溫度升高時表現出對更低質量濃度余氯敏感。游離余氯和化合余氯25 ℃時96 h半致死質量濃度分別為5.437、32.943 mg/L,30 ℃時分別為4.854、29.415 mg/L,35 ℃時分別為4.455、27.290 mg/L,表明游離余氯對幼蟹的急性毒性約為化合余氯的6倍。96 h內,每1 ℃溫升和1 mg/L游離余氯增加導致死亡率增加0.316%,而每1 ℃溫升和1 mg/L化合余氯增加導致死亡率增加0.027%,溫升耦合游離余氯下擬穴青蟹幼蟹死亡率提高值明顯高于化合余氯?；?6 h半致死質量濃度,25～35 ℃,游離余氯安全質量濃度為0.446～0.544 mg/L,化合余氯安全質量濃度為2.729～3.294 mg/L。