整合素β4通過PI3K/AKT/mTOR促進HCC增殖和遷移

唐小龍,曹念蝶,宋雪翼,邵倩倩

(安徽理工大學醫學院,安徽 淮南 232001)

肝癌是一種高致死性的惡性腫瘤,其發病率和死亡率在全球范圍內均呈現上升趨勢[1]。據 2020 年全球癌癥發病率、死亡率和患病率數據顯示,全球肝細胞癌排名第6,其相關死亡情況也是癌癥的常見原因[2]。雖然近年來對于肝癌治療的研究取得了一些進展,但由于復雜的發生發展機制,肝癌的治療仍然具有極大的挑戰性[3]。因此,尋找新的治療方法和藥物顯得至關重要。

整合素β4(integrin β4,ITGB4)是一種跨膜受體蛋白,它在多種惡性腫瘤中被過度表達,包括肝癌[4-5]。有研究證明ITGB4可以促進癌細胞的增殖和遷移,并且與肝癌的預后密切相關[6-7]。在肝癌中ITGB4的高表達水平與較差的預后相關聯,其可通過調節細胞外基質附著和細胞周期進程來促進肝癌細胞的侵襲和轉移。抑制ITGB4的表達能有效抑制肝癌細胞的增殖和遷移[8-9],說明ITGB4是一個潛在的治療靶點。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是一個廣泛存在于各種生物體中的重要信號通路,它參與了多種生物學過程的調控,包括細胞增殖、代謝和凋亡等[10-11]。在肝癌中,PI3K/AKT/mTOR信號通路也被發現與肝癌的發生和發展密切相關,抑制該信號通路可抑制肝癌細胞的增殖和遷移[12-13]。新近研究顯示ITGB4可以通過PI3K/AKT/mTOR信號通路來調節細胞凋亡、增殖和遷移等生物學過程[14],但其在肝癌發生發展過程中對增殖和遷移的調控以及機制仍然不明。

本研究旨在探討ITGB4在HCC進展過程中的生物學效應與機制,利用RNAi和過表達ITGB4的技術,通過克隆形成實驗、劃痕愈合實驗等分析ITGB4對HCC增殖、遷移的影響,并通過Western blot探討ITGB4調控HCC發生發展的機制,以期更深入了解肝癌的發生發展,為肝癌的治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 細胞來源和培養

HepG2和SK-HEP-1細胞系來自明金生物科技有限公司(上海)。Huh7細胞系來自上海青旗有限公司。所有細胞系均使用RPMI 1640培養基(Gibco,美國)進行培養,并添加了15%的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。這些細胞系在37℃、保持5%CO2的條件下培養,隔天換液1次,以確保細胞生長的良好狀態。

1.2 試劑和化學品

p-PI3Kp85(#4228)、t-PI3Kp85(#4292)、p-AKT(Ser473) (#4060)、t-AKT (#4691)、p-mTOR(Ser2448) (#2971)和t-mTOR(#2972)抗體和Integrin β4 (#14803) XP? Rabbit mAb以及BeyoClickTMEdU-594細胞增殖檢測試劑盒主要購自Cell Signaling Technology (美國)和MCE生物有限公司(美國)。所有抗體在使用前用PBS按照一定比例稀釋。LV-ITGB4-shRNA1、2、3敲低ITGB4慢病毒來自吉滿生物科技(上海)有限公司;ADV-ITGB4過表達腺病毒載體來自通用生物(安徽)有限公司。

1.3 Western blot

用細胞裂解液提取細胞和組織的總蛋白,然后將蛋白與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1的比例混合,在沸水中變性20min。定量樣品注入10% SDS-PAGE膠孔中進行電泳,條件為80mV 30min的濃縮、80min的分離。電泳完成后,將膠內蛋白轉移到PVDF膜上,并在5%脫脂牛奶中室溫封閉3h。PVDF膜置入TBST溶液中清洗3次,每次10min。將PVDF膜放入一抗工作液中4℃孵育過夜,次日放入二抗工作液中,室溫孵育1h,TBST溶液中清洗3次。最后在PVDF膜上均勻涂上顯影液,經顯影儀檢測和拍照。

1.4 細胞增殖分析

將1×105個細胞均勻種植在24孔板中,在37℃ 恒溫培養箱中培養24h后,棄培養液并注入500μL含有EdU-594(10μM)的培養液繼續培養2h后,用4%多聚甲醛固定細胞15min,0.3%Triton透化10min。根據試劑說明書加入配制好的500μL click反應液避光孵育30min。用含3% BSA的PBS洗滌細胞3次后,DAPI染核10min,洗滌細胞3次后置熒光顯微鏡下檢測紅色熒光細胞核的比例,以評估細胞增殖活力。

1.5 劃痕愈合實驗

將5×105個細胞均勻接種于12孔板中,使其生長至鋪滿底部。然后用10μL槍頭在每個孔中垂直劃3道相互平行的痕跡,吸棄培養液后換成無血清培養基,并在0h和48h置顯微鏡下采圖。使用Image J軟件測量痕跡大小,以評估細胞的遷移能力。

1.6 Transwell檢測

用8μm孔徑的Transwell小室進行細胞侵襲分析。將無血清培養基(100μL)中的3×105細胞接種到Transwell的上室;同時在下室中添加含有10%胎牛血清的培養基,總體積為 500μL;37℃培養48h后,去除膜上側未遷移的細胞;遷移的細胞用甲醇固定30min,結晶紫溶液染色,并在顯微鏡下觀察和拍照。通過計算3個隨機視野中的細胞數評估跨膜遷移的情況。

1.7 克隆形成能力分析

取對數生長期的細胞,將細胞用胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞。將細胞以1 000個細胞/孔水平接種于6孔板中,并在37℃下培養兩周。當細胞形成肉眼可見的集落時,用4%多聚甲醛固定15min,結晶紫染色30min后,拍照并計數細胞集落。

1.8 統計分析

每個實驗都至少進行了3次重復,并且數據均以平均值±標準差表示。采用未配對雙尾Student’s t檢驗或單因素方差分析來衡量各數值之間的差異。P<0.05則認為具有統計學意義。所有的分析都使用了SPSS 13.0統計軟件。ImageJ 1.44P軟件用于免疫印跡的定量分析。

2 結果與分析

2.1 ITGB4在HCC中高表達

應用TCGA數據庫分析顯示,ITGB4在不同腫瘤中均有一定水平的表達,其中在肝細胞性肝癌(LIHC)中的表達水平比DLBC、KICH等其他類別的腫瘤表達量高(見圖1a)。根據TCGA數據庫分析,肝細胞性肝癌中ITGB4的表達量也顯著高于肝細胞性肝癌的癌旁組織,如圖1(b)所示。進一步應用Western blot分析發現ITGB4在HCC細胞株中的表達狀況,結果顯示HepG2細胞系中ITGB4水平低于Huh7和SK-HEP-1細胞系(P<0.01),但顯著高于正常肝細胞系L02 (見圖1c)。免疫熒光染色檢測結果也證實Huh7細胞系中ITGB4水平高于HepG2細胞系,且ITGB4主要富集于肝癌細胞膜上,部分存在于胞核中(見圖1e)。為探討ITGB4在肝癌中的生物學效應,用ITGB4的3個不同基因序列敲低慢病毒載體轉入Huh7中,發現ITGB4-shRNA1轉染效率最好,因此應用ITGB4敲低慢病毒(ITGB4-shRNA1)構建了ITGB4敲低表達的肝癌細胞系Huh7ITGB4-(見圖1f)。再用ITGB4過表達腺病毒載體構建了ITGB4高表達的肝癌細胞系HepG2ITGB4+,如圖1(h)所示。應用ADV-ITGB4過表達腺病毒載體處理后,顯著上調了HepG2ITGB4+細胞中ITGB4水平,而構建的Huh7ITGB4-中ITGB4的表達相對于親代Huh7則顯著下調(P<0.01)(見圖1i)。

2.2 ITGB4促進HCC細胞增殖

應用EdU-594分析ITGB4對HCC細胞增殖實驗的影響,結果如圖2(a)所示,與Huh7細胞相比,Huh7ITGB4-細胞中增殖指數陽性率顯著下降(P<0.01);而HepG2ITGB4+細胞相對于親代細胞HepG2,EdU標記陽性率則顯著升高(見圖2c)。在克隆形成實驗中,Huh7ITGB4-較Huh7克隆成團率低,而HepG2ITGB4+細胞相比HepG2克隆形成率則顯著升高(P<0.01),結果如圖2(e)所示。這些結果說明ITGB4促進了肝癌細胞的增殖。

2.3 ITGB4促進HCC細胞遷移和侵襲

通過劃痕愈合和Transwell實驗進一步探究ITGB4對HCC遷移和侵襲性能的影響,與Huh7細胞相比,Huh7ITGB4-細胞劃痕愈合性能顯著下降(P<0.01)(見圖3a)。而HepG2ITGB4+細胞劃痕愈合性能則比HepG2細胞顯著上調(P<0.01)(見圖3c)。同樣,在Transwell實驗中HepG2ITGB4+細胞穿過Transwell的細胞率比HepG2細胞顯著增加(P<0.001);而Huh7ITGB4-細胞穿過Transwell的細胞占比顯著低于Huh7細胞(P<0.01)(見圖3e)。以上結果表明,ITGB4有利于促進HCC細胞遷移和侵襲性能。

圖3 ITGB4促進細胞遷移和增殖

2.4 ITGB4激活PI3K/AKT/mTOR信號通路

為了探究ITGB4介導HCC細胞增殖、遷移和侵襲等生物學效應的具體調控機制,通過Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化水平,結果如圖4所示,在Huh7和HepG2細胞中,下調ITGB4表達(Huh7ITGB4-)導致p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著下調(P<0.01);而上調ITGB4表達(HepG2ITGB4+)導致p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著增加(P<0.01)。這些結果表明ITGB4可能通過PI3K/AKT/mTOR介導HCC細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學功能。

圖4 ITGB4可調節PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活

2.5 抑制PI3K/AKT/mTOR通路下調HCC的增殖和遷移

為了探討ITGB4調控PI3K/AKT/mTOR信號通路活化水平的生物學效應,本研究比較了HepG2和HepG2ITGB4+細胞中PI3Kp85、AKT和mTOR的活化水平,結果如圖5(a)所示,ITGB4過表達導致p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平增加。進一步應用PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑(PKI-587)處理顯著抑制了HepG2ITGB4+細胞中的PI3Kp85、AKT和mTOR活化(P<0.01)。為了研究PKI-587對HCC增殖與遷移性能的影響,本文分別應用克隆形成實驗和劃痕愈合實驗驗證了PKI-587對HepG2細胞增殖和遷移能力的抑制作用。如圖5(c)所示,在HepG2ITGB4+細胞中添加PKI-587能有效地抑制HepG2ITGB4+細胞增殖(P<0.01);如圖5(f)所示,劃痕愈合實驗同樣證明添加PKI-587處理組顯著抑制了HepG2ITGB4+的遷移能力(P<0.01)。這些結果表明,ITGB4可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路上調HCC細胞的增殖性能和促進HCC細胞的遷移。

圖5 PKI-587逆轉了ITGB4誘導的肝癌細胞的增殖,遷移

3 討論

肝癌是一種高致死性的腫瘤,其發生和發展是一個復雜的多因素共同作用的過程。ITGB4作為一種跨膜糖蛋白受體可介導細胞間或細胞基質之間的粘附,并轉導調節基因表達和細胞生長的信號。本研究證實在肝癌細胞中ITGB4的表達量顯著高于正常肝細胞,且能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路介導肝癌的進展。

已有研究證實,ITGB4在肺癌等多種癌癥中都表達上調,然而ITGB4在肝癌組織中的表達狀況、具體功能和分子機制還不完全清楚[15]。有文獻表明,和其他腫瘤一樣,肝細胞癌中也存一定水平的ITGB4表達且顯著高于癌旁組織[16]。本研究證實,相對于正常肝細胞,ITGB4在HCC的細胞系中存在不同程度的上調表達。而ITGB4在人肝癌細胞系Huh7和HCCLM3中高表達,并且在這兩株細胞株中敲低ITGB4則會抑制HCC的遷移和侵襲[17]。不過也有研究表明相對于高侵襲性HCC細胞株(HLF,MHCC97L,MHCC97H,HCCLM3),ITGB4在低侵襲性Huh7細胞中低表達或不表達。但是也有文獻指出ITGB4在肝癌組織中高表達,而在癌旁組織中低表達或不表達[18]。本研究比較的是ITGB4在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達量,結果顯示相對于正常肝細胞,ITGB4在肝癌細胞Huh7和HepG2中高表達,且在Huh7細胞中的表達量高于HepG2細胞。此外,由于Huh7肝癌細胞在培養過程中具有較高的遺傳變異率,不同的代次可能有不同的表達模式,這也可能導致不同研究之間存在一定差異性?？偠灾?眾多研究均已表明ITGB4在肝癌細胞中普遍存在,有可能在肝癌的進展中發揮重要作用。其中已有文獻報道肝癌組織中的ITGB4水平高于癌旁組織,HCC細胞中的ITGB4水平高于正常肝細胞,并且ITGB4的表達與肝癌的分級和侵襲性呈正相關[19]。以上文獻報道為本研究結果提供了一定的支撐和驗證,未來本課題組將在此研究基礎上,進一步收集更多不同組織類型的臨床肝癌標本,分析ITGB4的表達及其與患者預后相關指標之間的關系,以探討ITGB4作為肝癌潛在治療靶點的價值。

細胞遷移、侵襲和增殖是肝癌惡性進展的重要特征。ITGB4能與ECM基質等成分結合,調節膠原酶等酶的活性,促進肝癌細胞的侵襲和遷移[20]。本研究通過過表達/敲低ITGB4表達實驗,結果表明下調ITGB4可以抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲;而上調ITGB4則增強了HepG2細胞的相關生物效應,說明ITGB4的表達可以促進肝癌的轉移和惡性進展。ITGB4的高表達與肝癌患者的預后不良相關,同時ITGB4還可以通過調節NF-κB信號通路促進肝癌細胞的增殖和遷移[21],這些研究有力地證實了ITGB4在肝癌中的促進作用。

PI3K/AKT/mTOR途徑是腫瘤細胞中最為重要的信號途徑之一,其異常激活參與了肝癌細胞的生長、遷移和抗凋亡等生物學過程[22]。本研究結果表明ITGB4上調PI3K/AKT/mTOR的激活,且AKT/mTOR信號通路的抑制劑(PKI-587)可以有效抑制ITGB4活化的PI3K/AKT/mTOR信號通路,并逆轉了ITGB4介導的HCC增殖、遷移和侵襲;應用RNAi技術沉默ITGB4同樣可以有效地抑制HCC細胞中的PI3K/AKT/mTOR通路活化及其驅動的HCC增殖、遷移和侵襲等生物效應,這些研究都支持了本文所述的PI3K/AKT/mTOR信號通路在肝癌中的重要作用。顯然,深入探討ITGB4和PI3K/AKT/mTOR通路之間的相互作用,對治療和預防HCC的臨床應用具有重要意義。

綜上可知,ITGB4至少部分參與介導PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活,進而參與調控肝癌細胞的增殖和遷移等生物學效應。因此,干預ITGB4表達有望成為治療該癌癥的潛在靶點。未來需要進一步開展相關實驗,以探究ITGB4在肝癌治療中的應用價值,并尋找更加有效的干預策略。