PKM2和ALDOA在胃癌中的表達與病理特征的相關性

周淑萍,盛曉曼

(1.安徽理工大學第一附屬醫院,安徽 淮南 232001;2.安徽理工大學醫學院,安徽 淮南 232001)

胃癌(gastric cancer,GC)是中國最常見的惡性腫瘤之一。根據2020年的數據分析顯示,在中國胃癌的發病率占所有癌癥發病率的10%,僅次于肝癌和結直腸癌;在所有癌癥中,胃癌的死亡率排第3位,僅在肺癌和肝癌之后[1]。由于早期胃癌的癥狀并不典型,部分患者僅表現為腹痛、腹脹,因而并未引起重視,待到確診時病程已進入進展期。經過及時治療,早期胃癌的5年生存率可達95%以上;但中晚期胃癌即便進行了外科手術,患者的中位生存時間仍舊不到1年[2]。因此,雖然近年來胃癌的診療技術有所提高,但胃癌仍是造成中國癌癥負擔的重要因素之一。

在胃癌診斷標志物的研究中,常規用于臨床的生物標志物有HER-2、CEA和CA19-9等,但這些標志物在早期診斷方面仍缺乏足夠的特異性和敏感性[3]。在胃癌的治療中,雖然曲妥珠單抗、雷莫蘆單抗和阿帕替尼等藥物被批準用于晚期胃癌的治療,但由于胃癌的發病機制復雜和高度異質性的特點,使其靶向治療的作用有限[4]。因此,探索胃癌的發病機制、發現有助于胃癌早期診斷的生物標志物、提高胃癌的早期診斷率并尋找新的治療靶點有非常重要的意義。

有研究表明糖酵解在腫瘤的發生發展中起著重要作用,由于腫瘤細胞的繁殖十分迅速,使其即使處在正常的氧氣濃度下依然會消耗葡萄糖產生大量乳酸,這種現象被稱作“Warburg效應”或“有氧糖酵解”[5]。M2型丙酮酸激酶[6](M2 isoform of pyruvate kinase,PKM2)和醛縮酶A[7](transcriptional levels of aldolase A,ALDOA)與糖酵解關系密切,并在腫瘤細胞中高度表達,可作為新的腫瘤標志物在腫瘤的早期診斷及預后判斷中發揮一定作用。本研究采用免疫組化技術(immunohistochemistry,IHC)檢測胃癌細胞中PKM2和ALDOA的表達情況,并與胃癌組織的病理特征進行對比分析,探索其在胃癌的發生、發展及預后中的作用,以期為臨床上胃癌的診斷和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究以2020年至2022年間于安徽理工大學第一附屬醫院普外三科行胃癌根治術的30例患者為研究對象。所有患者均術后均對手術標本進行病理活檢,并進行TNM分期,確保獲得完整的臨床病理數據。納入與排除標準如下,納入標準:①病理活檢確診為胃癌;②圍手術期內未出現死亡事件;③所有病例手術前均未接受過任何放射及化學治療。排除標準:①臨床資料不完整;②合并其他惡性腫瘤;③合并其他嚴重疾病。

1.2 免疫組織化學法檢測

胃癌組織中PKM2和ALDOA的表達用免疫組織化學法檢測:①將切片脫蠟至水化;②抗原修復;③用3%的過氧化氫水溶液阻斷內源性過氧化物酶;④血清封閉30min;⑤甩掉封閉液,滴加1∶200比例稀釋PKM2一抗(貨號bs-0101R,購自bioss)或者ALDOA一抗(貨號BS-2406R,購自bioss),置于濕盒內4℃孵育過夜;⑥加入1∶200比例稀釋的二抗(HRP 標記的山羊抗兔IgG,貨號GB23303,購自Servicebio);⑦用DAB顯色液對其染色;⑧用蘇木素復染細胞核;⑨經脫水封片后置于白光顯微鏡下進行結果分析。細胞核經蘇木素染色后呈藍色,PKM2和ALDOA經DAB顯色后均為棕黃色。

1.3 評分標準

每張完成染色的標本切片交予兩名高年資病理專家于200倍鏡下對細胞染色強度及細胞陽性率進行判讀。細胞染色強度判定:胞質無著色為0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分;細胞陽性率判定:0～5%判為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、≥76%為4分。最終得分以細胞陽性率(0～4分)與染色程度(0～3分)的分值相乘,0分為(-)、1～4分為(-/+)、5～8分為(+)、9～12分為(++),其中以(++)為其在胃癌組織中高表達。

1.4 統計學方法

2 結果與分析

2.1 受試者基本特征

納入研究的30名受試者其中,男性16例,女性14例;年齡≤60歲的患者6例,>60歲的24例,平均年齡為(68.77±8.25)歲;腫瘤浸潤深度:T1～T2的有10例,T3～T4的有20例;有/無淋巴轉移的有10/20例;早期(Ⅰ+Ⅱ期)患者13例,晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者17例;腫瘤最大直徑:<5cm的有18例,≥5cm的有12例;低分化患者14例,中/高分化患者16例;血管侵犯有/無分別為20例、10例,神經侵犯有/無分別為12例、18例。

2.2 PKM2和ALDOA在胃癌中的表達

PKM2主要在細胞質中表達,DAB染色呈彌漫的棕褐色。免疫組化結果根據染色程度和細胞陽性率對PKM2的表達強度進行判定。如圖1(a)所示PKM2的表達強度為“-”,圖1(b)表示PKM2的表達強度為“-/+”,圖1(c)表示PKM2的表達強度為“+”,圖1(d)表示PKM2的表達強度為“++”。

圖1 PKM2在胃癌組織中的表達(×200)

ALDOA同樣在細胞質中表達,免疫組化DAB顯色及結果判定與PKM2相同。如圖2(a)所示ALDOA的表達強度為“-”,圖2(b)表示ALDOA的表達強度為“-/+”,圖2(c)表示ALDOA的表達強度為“+”,圖2(d)表示ALDOA的表達強度為“++”。

圖2 ALDOA在胃癌組織中的表達(×200)

如圖3所示,在胃癌組織中,PKM2高表達17例,低表達13例,高表達率為57%;ALDOA高表達18例,低表達12例,高表達率為60%。

圖3 PKM2和ALDOA的陽性表達數

2.3 PKM2的表達與胃癌病理特征的關系

如表1所示,浸潤深度為T1～T2的胃癌組織中PKM2的高表達率為20%(2/10),低于T3～T4組的75%(15/20);TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的胃癌組織中PKM2高表達率為31%(4/13),低于Ⅲ～Ⅳ期的76%(13/17);低分化組中PKM2的高表達率為29%(4/14),低于中/高分化組的81%(13/16);PKM2的表達與胃癌組織的浸潤深度、TNM分期及分化程度具有相關性,差異均具有統計學意義(P<0.05)。而其他因素如性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴轉移、神經和血管侵犯,與PKM2的表達未見明顯相關(P>0.05)。

表1 PKM2的表達與臨床病理特征的關系

2.4 ALDOA的表達與胃癌病理特征的關系

如表2所示,浸潤深度為T1～T2的胃癌組織中ALDOA的高表達率為30%(3/10),低于T3～T4組的75%(15/20);低分化組中ALDOA的高表達率為36%(5/14),低于中/高分化組的81%(13/16);ALDOA的表達與胃癌組織的浸潤深度和分化程度具有相關性,差異均具有統計學意義(P<0.05)。其他因素如性別、年齡、有無淋巴轉移、TNM分期、腫瘤大小和有無神經、血管侵犯,與ALDOA的表達未見明顯相關(P>0.05)。

表2 ALDOA的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移等惡性生物學行為是造成患者死亡的主要原因,這種惡性生物學行為需要大量的能量支持,其中糖代謝是腫瘤細胞最主要的供能方式之一。由于腫瘤的快速增長,即便在正常氧氣濃度下,腫瘤細胞也始終處在一種微缺氧狀態,導致腫瘤細胞的供能方式從氧化磷酸化轉為糖酵解。這種適應性反應被稱為“Warburg效應”或“有氧糖酵解”。因此,作用于糖酵解途徑中的酶可能會在癌癥組織中受到調控[8]。丙酮酸激酶作用于糖酵解途徑,可催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP反應并產生丙酮酸和ATP。其中PKM2常在一些需大量增殖的細胞和大多數的腫瘤細胞中被發現。PKM2有兩種表現形式:一種是主要作用于有氧氧化的高活性四聚體,另一種是有利于有氧糖酵解的低活性二聚體[9-10]。這兩種形式表現出來的動態平衡可使腫瘤細胞在營養不足的環境下調節自身合成和營養代謝,從而起到促進腫瘤發生發展的作用。除了與惡性腫瘤的發生相關外,PKM2的過表達還可以反應腫瘤的預后。與正常組織相比,PKM2在腫瘤組織中的mRNA和蛋白質水平都過表達,并且PKM2蛋白的表達和胃癌患者的生存率呈負相關,從而PKM2的表達可以被認為是胃印戒細胞癌患者預后的危險因素之一[11]。文獻[12]的研究進一步表明了PKM2的高表達對維持GC細胞的惡性表型起著重要作用,抑制PKM2依賴性的糖酵解可能成為胃癌治療的新方向。本研究應用IHC技術對胃癌患者的術后標本進行檢測,結果發現,30例胃癌組織標本中,PKM2高表達的有17例,其高表達率為57%。進一步比較發現PKM2的表達與胃癌組織的浸潤深度、TNM分期以及分化程度有關,即PKM2的表達率隨著病情的推進而升高,與之前的研究結果相符。

ALDOA作為一種調節酶,不僅參與糖酵解,還參與調節糖異生[13]。糖酵解和糖異生都可為腫瘤細胞的增殖提供能量,越來越多的研究證明ALDOA在幾種癌癥的病理進展中也起著重要作用。文獻[14]研究發現ALDOA在子宮頸宮頸腺癌中的高表達與淋巴結轉移、淋巴血管浸潤還有總生存期短相關,而ALDOA的表達被抑制后則明顯降低了宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲性。文獻[15]對肝內膽管癌的研究得出,ALDOA高表達與患者的預后呈負相關,同時發現ALDOA介導的糖酵解增強是促進腫瘤細胞增殖和轉移的因素之一。上述結果在肺癌[16]、肝癌[17]和腎癌[18]的研究中均能得到驗證。本研究顯示,在30例胃癌組織標本中,ALDOA高表達的有18例,其高表達率為60%,并且與胃癌組織的浸潤深度和分化程度具有相關性,即ALDOA的表達同樣隨著胃癌病情的進展而增加。本研究所得結果與ALDOA在其他多種癌癥中的表達情況一致,提示ALDOA同樣促進了胃癌的發生發展,可以為胃癌診斷和治療提供新的思路。

本研究發現PKM2和ALDOA的表達是隨著疾病的進展而增加,表明作為糖酵解調節酶的PKM2和ALDOA或許可通過增強供能在腫瘤的生長過程中發揮著重要作用,促進腫瘤的發生發展;而抑制PKM2和ALDOA的表達、阻斷二者的作用途徑,或許可以作為胃癌治療的新靶點。TNM分期是影響腫瘤預后的關鍵因素,本研究發現PKM2和ALDOA的表達與TNM的分期具有相關性,這表明通過檢測PKM2和ALDOA的表達強度有助于判斷病人預后及危重程度,從而制定最佳的治療方案。

4 結論

本研究顯示,PKM2和ALDOA在胃癌組織中均存在高表達,并且與疾病的進展存在相關性。這表明胃癌組織中可能存在通過增強糖酵解來促進腫瘤發生發展的機制,因此阻斷PKM2和ALDOA、抑制糖酵解或許會為胃癌的治療指明新方向。之前的研究認為,癌癥的TNM分期與疾病的預后緊密相關。本研究得出PKM2和ALDOA的高表達與腫瘤的浸潤、TNM分期明顯相關,因而推測這兩種酶或許可以作為胃癌發生發展的重要標志物,并借此來估計胃癌的預后。

本研究樣本量較小,所得的結果可能存在偏差,還需進一步擴大樣本量以證實上述結果?？紤]到手術病理切片的獲取過程相對繁雜,后續的實驗計劃可從胃癌患者的血清著手,研究PKM2和ALDOA在血清和組織切片中是否是相同的表達模式,為開發新的血清學胃癌標志物奠定理論基礎。