血葉蘭組培苗與內生真菌共生培養的生長效應研究

楊澤秀，陳英轉，吳文碟，鐘云芳，陳耀麗，3

1.海南珠峰園林科技有限公司，海南 ?？?570220；

2.熱帶特色林木遺傳與種質創新教育部重點實驗室/海南大學林學院，海南 ?？?570228；

3.福建江南春城市建設集團有限公司，福建 漳州 363005

蘭科是高級進化類群，是集藥用、觀賞和科研作用于一體的植物[1]，同時也是十分典型和極具代表性的菌根植物，其菌根的共生真菌是公認人工栽培、引種馴化、資源再生和保護的重要決定性因子[2]。蘭花的菌根是蘭科植物根系與真菌形成的菌根共生體，菌根的營養來源對宿主植物的生活和營養造成一定的影響[3]。因此，蘭花內生真菌和組培苗共生的研究對蘭科的保育、移栽煉苗管理及藥用藥理開發具有重要的意義。

血葉蘭（Ludisia discolor）是蘭科血葉蘭屬的多年生草本植物，植株的根莖匍匐生長，莖節形態較為明顯，像蠶一樣趴在堅硬的石頭上，故也被稱為“石上藕”。血葉蘭干燥的植株有安神健脾、治療食欲不振等效果。除藥用外，還可食用，有益氣健身等作用[4-5]。近些年研究發現，菌根真菌在帶葉兜蘭、鐵皮石斛和霍山石斛等蘭科植物的研究中均有相關的報道，進一步解釋了蘭科植物和菌根真菌之間關系的重要意義[6-7]。目前，因棲息地和生境的破壞，野生血葉蘭資源正在面臨威脅，有些地區甚至面臨枯竭，對野生血葉蘭資源保存的研究刻不容緩。組織培養、菌根技術及建立菌苗共生體系是實現血葉蘭資源保存的良好途徑。血葉蘭近年的研究主要集中在營養價值、開花物候、內生真菌分離與鑒定和組織培養[8-11]，而對血葉蘭與內生真菌共生培養的研究少見報道。因此，該研究在無菌血葉蘭組培苗上，將經過分離純化的菌株接種于血葉蘭組培苗中，培養3～4 個月，定時記錄實驗組培苗的生長指標，并與對照組進行比較，篩選菌苗共生的有效培養基，以期建立血葉蘭菌苗共生體系，為血葉蘭保育、菌根技術的研究提供一定的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇大小和長勢一致的無根無菌血葉蘭組培苗和經分離純化的內生真菌菌株保存備用。

1.2 實驗培養基

內生真菌在PDA 培養基中純培養，內生真菌和組培苗共生則在改良的DE 培養基中培養。

1.3 內生真菌與血葉蘭組培苗的初步篩選

長勢一致的無菌苗，洗凈苗根部并接種于DE 培養基中，每處理4 株無菌苗，經過1 周培養觀察，選擇無污染的組培苗和直徑為0.5cm×0.5cm 的供試真菌菌塊，兩者同時接種進行菌苗共生，以不接內生真菌的處理作為對照組，每處理重復10 次。實驗過程中細心觀察，1 個月后統計實驗結果，去除導致苗畸形的內生真菌，保留有益的菌株用于菌苗共生的培養實驗。

1.4 內生真菌與血葉蘭組培苗共生的篩選

將1.3 保留完好的菌株活化備用，選擇長勢一致的血葉蘭無菌苗，清除根部殘留培養基后置于精度為千分之一的電子天平上稱重，將處理過無菌苗有序接種于經過改良的DE 培養基上，每瓶接種4 株血葉蘭組培苗。

選取內生真菌接種于4 株組培苗的中間部位，每個處理重復10 次，以無菌PDA 塊作為對照組。培養3 個月后記錄各處理的無菌苗生長發育的效果，實驗期間去掉致死或發生畸形的菌株。再培養1 個月后進行數據的記錄，每個處理以隨機選擇10 袋組培苗作為一組，測定血葉蘭的生根數量、根系長度、植株高度等植物生長發育指標，測定不同內生真菌實驗組和對照組的生長發育指標可作為判斷內生真菌對血葉蘭組培苗效果的重要理論支撐。

1.5 煉苗培養基篩選

挑選經過菌苗共生，長勢一致的健壯組培苗進行煉苗實驗，溫室瓶內組培苗置放約2d 后擰松瓶蓋再放2d，為更好適應外部環境，再將瓶蓋完全打開2d。經過消毒的無菌鑷子小心取出血葉蘭無菌苗，洗凈組培苗再用濃度為50%的多菌靈溶液浸泡10min后微晾干種植在已配好的基質中?；|搭配的比例如表2，設置4 種不同基質處理，種植前攪拌均勻，并用水拌透，每個處理3 盤，每盤40 株。經過1 個月的移栽煉苗后，詳細記錄血葉蘭組培苗的存活率以及生長指標的狀態。

1.6 培養條件

恒溫25℃條件下培養，光照時間為12h（黑暗時間為12h），光照強度控制在1800lx～2300lx 之間。

1.7 數據處理

實驗采用Excel 2010 和SPSS 26.0 數據分析軟件對該實驗記錄的數據進行匯總以及差異性分析。

2 結果與分析

2.1 內生真菌對血葉蘭無菌苗生長指標的影響

實驗在野生血葉蘭植株中篩選出的66 株內生真菌中，發現大部分的內生真菌能夠導致血葉蘭組培苗死亡或致病，與血葉蘭不能共生培養（圖1）。對剩余的6 株菌株進一步篩選，培養3 個月后發現6株菌株在與血葉蘭組培苗共生培養中對組培苗的生長發育有一定的促進作用。共生培養G6 號菌株1 個月后，其內生真菌的菌絲在培養基上匍匐生長，基本無菌絲的纏繞（圖2），結果如表1。在組培苗鮮重方面，血葉蘭與G9（55.01%）和Y6 菌株（55.13%）共生培養的鮮重增長率與對照組（48.24%）相比有顯著差異，即（P＜0.05），血葉蘭在G6 號菌株中共生培養和血葉蘭在對照組中培養的鮮重增長率無顯著差異；在血葉蘭與G11 號、Y20 號2 個菌株共生培養中發現其鮮重增長率均顯著低于實驗對照組。在血葉蘭株高的測量中發現，血葉蘭經過與G6、G9 和G11 菌株進行共生培養的株高顯著高于實驗對照組；血葉蘭與G11 菌株共生培養的莖粗（3.59cm）顯著低于對照組（4.62cm），血葉蘭與其余的內生真菌共生培養的莖粗測量結果均與實驗對照組無顯著的差異。在血葉蘭根數方面，血葉蘭與G6 菌株共生培養促使血葉蘭生根效果較為明顯，其生根數（4.40 條）與實驗對照組（2.20 條）的效果最為突出，血葉蘭與Y21 號菌株共生培養的生根數低于對照組。在血葉蘭根長方面，血葉蘭與G11 （3.94cm） 和Y21 號菌株（3.39cm） 共生培養的根長均顯著高于對照組（2.84cm）。通過血葉蘭組培苗生長發育指標的考量，發現經過G9 號內生真菌處理的血葉蘭組培苗的生長發育效果優于其他處理組；其中G6 號內生真菌屬于鏈格孢屬，G9、Y21 內生真菌屬于炭疽病屬，G11、Y20 內生真菌屬于輪層炭菌屬，Y6 號內生真菌屬于木霉屬，說明同屬不同種類的內生真菌對血葉蘭組培苗的生長發育效果也有所差異。

表1 血葉蘭組培苗生長發育指標測定Tab.1 Determination of Growth and Development Index of Tissue Culture Seedlings of Ludisia discolor

圖1 A：共生致死的組培苗，B:正常共生的組培苗Fig.1 A：Ludisia discolor Seedlings by Lethal Symbiotic Culture，B：Normal Symbiotic Tissue Culture Seedlings

圖2 血葉蘭組培苗生長指標的測定Fig.2 Determination of Growth Index of Tissue Culture Seedling of Ludisia discolor

2.2 基質類型對菌苗共生種植煉苗的影響

植物組織培養煉苗移栽成功的關鍵在于成活率的占比。該實驗將血葉蘭移栽種植在4 種不同基質中一個半月后，發現血葉蘭組培苗移栽種植在不同基質類型中的成活率均在85%之上（見表2）。其中純水苔為基質的組培苗成活率為100%，血葉蘭無菌苗根系較為粗壯，植株長勢良好（圖3）；血葉蘭在松樹皮+泥炭土基質（95.5%）中種植，苗生長整齊，生長發育良好。綜上，血葉蘭以水苔作為種植基質的移栽效果最好。

表2 不同基質對血葉蘭煉苗成活率的影響Tab.2 Effects of Different Substrates on the Survival Rate of Ludisia discolor Seedling

圖3 血葉蘭的煉苗移栽（以水苔基質為例）Fig.3 Transplantation of Ludisia discolor Seedlings (Sphagnum Substrate as an Example)

3 結論與討論

3.1 結論

該研究從野生的血葉蘭實生苗中分離獲得66種內生真菌，有60 株內生真菌與植物存在著極為不利的關系，有6 株的內生真菌均對血葉蘭存在有利的關系，對苗具有促進效果。有益菌株分別為G6（鏈格孢屬）、G9 和Y21（炭疽病屬）、G11 和Y20（輪層炭菌屬）、Y6（木霉屬）等6 個菌株。血葉蘭與G9 號內生真菌進行共生培養時，其鮮重顯著增加（55.01%）；經過G6 和G9 菌株共生培養的血葉蘭無菌苗的株高、莖粗和生根數等生長發育指標均有顯著促進效果；經過G11 號菌株共生培養的血葉蘭無菌苗的根長有促進效果。綜上所述，血葉蘭與G9 號內生真菌進行共生培養的生長發育指標最好。血葉蘭以純水苔作為種植基質為宜，成活率達100%，植株茁壯成長。

3.2 討論

3.2.1 不同栽植基質對內生真菌與血葉蘭組培苗共生培養的影響

血葉蘭無菌苗移栽的成活與否跟種植的基質緊密相關。植物需要在組培室內異養條件或者半自養條件轉化為全自養條件，其濕度、光照強度和溫度對組培苗的成活起關鍵作用，基質類型也不例外[12]。血葉蘭在基質為V火山石:V泥炭土=3:1 中的成活率高達91.7%，在V泥炭土:V松樹皮:V珍珠巖=3:1:1 的種植基質中，血葉蘭組培苗的成活率達87.0%[13-14]。該實驗將水苔作為血葉蘭移栽煉苗的種植基質，經過有益菌株共生培養的血葉蘭的成活率高達100%，幾乎全部成活，植株健壯且生長發育狀態良好。原因可能是煉苗基地有遮陰網，空氣流暢，再加上水苔自身的保濕效果，使血葉蘭茁壯成長。該實驗以保水保肥能力強的純水苔作為種植基質，植株成活率高，這一研究結果與蘭科植物中的鐵皮石斛和潑墨石斛的移栽煉苗研究結果基本一致[15-16]。因此，血葉蘭的后期煉苗，采用水苔作為基質為宜。

3.2.2 血葉蘭共生真菌的篩選

內生真菌資源在蘭科植物中具有多樣性，植物中分離出來的菌株也有異同。不同的內生真菌在植物生長的各階段發揮的作用也不同，這與植物所處的環境和必需的營養物質等因素有關聯[1]?？v使蘭科內生真菌資源豐富，并非全部的內生真菌都能夠促進蘭科植物的生長，少量的內生真菌對蘭科植物組培苗具有致病性，出現這種現象的原因可能與接種內生真菌時的數量、菌苗共生的培養基和植物生長發育各階段均有關系[17-18]，植物所需營養超值和內生真菌菌絲的生長過于旺盛都會促使內生真菌和組培苗共生的關系難以達到和諧[19]。五唇蘭、海南鉆喙蘭、大花蕙蘭和鐵皮石斛等蘭科植物的菌苗共生培養都是選擇DE 的培養基作為內生真菌和組培苗共生的培養基[20-22]。

以改良的DE 培養基為實驗培養基，將從野生血葉蘭中分離出來的66 株內生真菌與血葉蘭無菌苗進行菌苗共生培養3 個月。結果顯示，在所有內生真菌中僅有6 株內生真菌在菌苗共生培養實驗中發揮一定的促進作用，占總資源比率的11.00%；有大量的內生真菌資源都會限制血葉蘭無菌苗的生長發育，使其生長狀態不佳，植株致死率高達89.00%。該實驗初篩的有益內生真菌6 株，其對血葉蘭組培苗的促生作用均有所不同。血葉蘭無菌苗的生根效果在G11 號內生真菌共生培養中較為明顯，組培苗根系最長；血葉蘭組培苗的鮮重在G9 號內生真菌共生培養中有所增加（55.01%），其株高（9.14cm）、莖粗（4.7mm）、根數（3.60 條）等生長發育指標效果均顯著優于其他菌株，原因可能是內生真菌種類的多樣對血葉蘭無菌苗的促生機制也多樣。內生真菌和金線蓮組培苗共生實驗中發現有5 株內生真菌對金線蓮組培苗的生長發育具有促進作用，其中3 株內生真菌分別為鐮刀菌屬、彎勁霉屬和曲霉屬[23]；而鐮刀菌屬、刺盤孢屬和鏈格孢屬等多是致病的內生真菌。研究發現從野生蘭科植物中獲得的鐮刀菌對同科植物鐵皮石斛的種子萌發具有促進效果[24]，說明并不是所有的鐮刀菌都會促使植物發病。鐮刀菌有致病鐮刀菌和非致病鐮刀菌之分[25]，而鐮刀菌屬具有一定刺激蘭科植物種子萌發的作用，也能控制作物的枯萎病[26-27]。綜上，說明蘭科植物的生長與鐮刀菌之間有著密切的關系。內生真菌的有利條件與植物宿主之間存在著協同的作用。植物內生真菌的豐富資源、維持機制和真菌與生態功能之間的關系需進一步探索。