膽總管結石合并膽管細胞癌患者手術前后HER2、Claudin18表達差異性及其與膽管疾病相關性和對預后的影響

馬大偉 鮑鴻斌 王亞琳 李寧 徐浩奕

(1衡水市人民醫院肝膽胰外科,河北 衡水 053000;2衡水市第四人民醫院急診科)

膽總管結石引發的膽管細胞癌是膽管上皮細胞增生發展為不典型增生及腺癌樣癌變的過程〔1〕。膽管細胞癌包括起源于膽管上皮的所有腫瘤,多數膽管細胞癌為腺癌,可分為肝內膽管細胞癌和肝外膽管細胞癌兩大類〔2〕。研究顯示,肝內膽管細胞癌是肝膽內管被覆上皮形成的原發性癌,病理機制及原因尚不明確,但與膽管疾病具有相關性〔3〕。由于肝內膽管細胞癌的特殊位置及較高的惡性程度,導致其死亡率較高,手術治療效果不理想,因此早期診斷和預防尤為重要,近年來探索新的診斷和預后相關因子已成為診斷和治療膽管細胞癌的研究重點〔4〕。人表皮生長因子受體(HER)2是一種糖蛋白,研究顯示其在肺癌、乳胃癌等多種癌癥中高表達,有望成為鑒別惡性腫瘤的新型指標〔5〕。Claudin-18是細胞間緊密連接結構的骨骼蛋白,眾多的研究已經證實其與肺癌、胃癌等癌癥存在密切關系〔6〕。但HER2和Claudin-18在膽管細胞癌中的相關研究尚無報道,推測其可能與膽管細胞癌存在關系。本研究探討HER2和Claudin-18在膽總管結石和膽管細胞癌患者手術前后的表達差異性及其與膽管疾病的相關性和對預后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月在衡水市人民醫院肝膽外科接受腫瘤手術治療的膽總管結石合并膽管細胞癌患者50例為膽管癌組,患者均經病理檢查確診,其中男26例,女24例,平均年齡(62.3±10.2)歲。單純膽總管結石患者50例為膽總管結石組,男23例,女27例,平均年齡(61.5±11.4)歲。同期體檢健康者50例為健康組,男27例,女23例,平均年齡(62.8±10.5)歲。按照2019年版世界衛生組織(WHO)膽管細胞癌組織學分級,高分化15例,中分化13例,低分化22例;Ⅰ～Ⅱ級19級,Ⅲ～Ⅳ級31級。研究對象均知情同意。納入標準:(1)臨床診斷符合膽總管結石合并膽管細胞癌〔7〕,并經病理診斷確診;(2)術前未進行化療、放療治療;(3)預期生存時間≥3個月;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)伴有各臟腑器官及腦血管、血液等嚴重疾病者;(2)患有其他腫瘤者。本研究已通過醫院倫理委員會批準。

1.2檢測外周血HER2 和Claudin-18 采集兩組患者術前和術后空腹1 w血液3～5 ml,離心后獲取血清,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)檢測HER2 和Claudin-18蛋白表達。

1.3免疫組化法檢測組織中HER2 和Claudin-18表達 獲取術中膽總管結石合并膽管細胞癌患者癌組織及癌旁組織樣本、膽總管結石患者的膽管組織。樣本處理:HER2多克隆抗體(美國Dako公司),SP法免疫組化試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。石蠟切片脫水,加3%H2O2室溫靜置10 min去除內源性過氧化酶,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂后檸檬酸熱抗原修復,PBS漂洗3×5 min;加入山羊血清,2 h后,漂洗2次,加一抗(1 μg/ml),4 ℃孵育過夜,再漂洗3×5 min,加二抗,經室溫孵育,漂洗后,加入二氨基聯苯胺(DAB)染色液,顯微鏡下觀察,蘇木素復染,脫水,透明,封片。采用Formwitz半定量積分法,光學顯微鏡下每張切片隨機選取5個100倍視野,計數陽性細胞并觀察染色強度。0分:陽性細胞比率≤5%,染色強度無色。1分:陽性細胞比率6%～25%,染色強度淡黃色。2分:陽性細胞比率26%～50%,染色強度黃色。3分:陽性細胞比率51%～75%,染色強度棕黃色。4分:陽性細胞比率>75%?？偡譃殛栃约毎嚷逝c染色強度評分之積:陰性0分,標記為(-);弱陽性1～4分,標記為(+);中等陽性5～8分,標記為(),強陽性9～12分,標記為();低表達0～8分,高表達9～12分。

1.4Western印跡檢測HER2 和Claudin-18蛋白表達 提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白量,電泳轉膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入羊抗人Claudin-18、HER2(1∶500)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),稀釋1∶1 000的β-actin單克隆抗體,4 ℃孵育過夜,PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgG(北京博爾西科技有限公司),二抗室溫孵育2 h,PBST洗滌后顯色、曝光、顯影、定影。實驗重復2次。

1.5術后隨訪 術后每3個月對患者隨訪1次,隨訪最長時間為3年,記錄患者生存時間,有無轉移等,統計存活率并進行生存分析。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1各組血清中HER2和Claudin-18水平(P>0.05) 術前及術后觀察組血清HER2和Claudin-18水平顯著高于術前及術后對照組和健康組(P<0.05);健康組與對照組術前、術后及組間比較水平無顯著差異(P>0.05)。術后觀察組血清HER2和Claudin-18水平顯著低于術前(P<0.05),見表1。

表1 各組手術前后血清HER2和Claudin-18水平比較(n=50,μg/L)

2.2兩組組織中HER2和Claudin-18陽性率比較 癌組織中HER2和Claudin-18陽性率(94.0%、92.0%)顯著高于膽管組織(8.0%、6.0%)及癌旁組織(10.0%、8.0%;均P<0.05),癌旁組織與膽管組織間陽性率比較無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組織中HER2和Claudin-18表達(免疫組化,×200)

2.3膽管細胞癌患者HER2、Claudin-18與臨床病理的相關性 HER2、Claudin-18表達水平與性別、年齡無顯著相關性(P>0.05),與組織學分級、血管浸潤程度、淋巴結轉移程度呈正相關(r=0.621、0.322、0.628,均P<0.05),與細胞分化程度呈負相關(r=-0.372,P<0.05)。HER2與Claudin-18具有正相關關系(r=0.723,P<0.05)。經檢測膽管細胞癌患者HER2高表達34例,低表達16例,Claudin-18高表達37例,低表達13例。HER2、Claudin-18表達水平在性別、年齡方面無顯著差異(P>0.05),在組織學分級、分化程度、血管浸潤程度、淋巴結轉移方面差異明顯(P<0.05)。見表2。

表2 膽管細胞癌患者HER2、Claudin-18高表達與臨床病理的相關性(n)

2.4Western印跡檢測不同分化程度膽管細胞癌組織中HER2、Claudin-18蛋白表達 不同分化程度的膽管細胞癌組織HER2、Claudin-18表達顯示,低分化表達顯著高于中分化,中分化顯著高于高分化(P<0.05)。見表3。

表3 不同分化程度膽管細胞癌組織中HER2、Claudin-18蛋白表達

2.5膽管細胞癌患者HER2、Claudin-18與預后關系 術后隨訪3年,HER2高表達34例,死亡13例,低表達16例,死亡1例。Claudin-18高表達37例,死亡13例,低表達13例,死亡1例。與低表達患者相比,高表達HER2、Claudin-18患者生存時間顯著較短(P<0.05)。見圖2。

圖2 膽管細胞癌組織中HER2、Claudin-18表達與預后關系

2.6影響肝內膽管細胞癌患者預后的危險因素 針對膽管細胞癌患者相關臨床指標:HER2、Claudin-18、膽總管結石、膽囊結石、肝硬化、脂肪性肝炎進行Logistic回歸分析顯示,HER2、Claudin-18、肝硬化、膽總管結石是肝內膽管癌發病的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 膽管細胞癌患者發病的危險因素Logistic回歸分析

2.7靈敏度、特異性曲線 HER2、Claudin-18的受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示,HER2、Claudin-18曲線下面積分別為0.874(0.794～0.954)、0.977(0.970～0.984),具有很高的檢測靈敏度(P<0.05)。見圖3。

圖3 HER2、Claudin-18檢測對膽管細胞癌診斷的ROC曲線

3 討 論

膽總管結石易致膽汁滯留且常伴有不同程度的膽管機械性損傷或感染進而引起慢性炎性增生不典型增生甚至發展為膽管細胞癌變。膽總管結石合并膽管細胞癌預后極差,患者在發現時往往已屬晚期〔8〕。手術治療是膽總管結石合并膽管細胞癌的有效方式,手術可將癌組織結石同時去除,減少復發可能性,延長術后生存時間。研究顯示,早發現膽管細胞癌對于治療方案的制定和時機把握及預防術后復發有重要意義〔9〕。HER2、Claudin-18在很多腫瘤組織中表達水平升高,并與預后存在相關性,本研究結果表明,HER2、Claudin-18在膽管細胞癌的病情中存在表達差異,可能與病情發作存在關系。

HER2在細胞分裂增殖及信號跨膜轉導中具有重要作用,其擴增和過度表達與人類癌癥和轉移有關〔10〕。HER2的擴增是腫瘤侵襲性的一個因素,其與更頻繁的復發和較差的生存率相關〔11〕。也有研究發現,在超過1/4的轉移性乳腺癌中HER2受體過度表達〔12〕,另外也有很多研究發現,卵巢癌、胃癌等多種癌癥中HER2表達增強。本研究結果提示,HRE2可能參與了膽管細胞癌的病情發展。Claudin蛋白是一類參與構成細胞緊密連接的細胞表面分子,共包含了27種亞型,Claudin-18是其中之一,其功能主要為維持細胞間黏附調節細胞旁通透性維持細胞極性〔13〕。研究顯示,Claudin-18蛋白在局部差異性表達將會造成細胞屏障功能的改變,在腫瘤發生和遷移過程中發生作用〔14〕。研究顯示,在胃癌組織中Claudin-18蛋白表達降低并與轉移程度呈負相關〔15〕,在膽管組織中Claudin-18表達高于健康組織〔16〕。本研究結果提示,Claudin-18可能參與了膽管細胞癌的發生和發展。由以往研究及本研究結果可見,HETR2、Claudin-18可能參與了腫瘤的發生、侵襲、轉移等過程,并在多種癌細胞的細胞膜表面表達,這使其成為靶向治療靶點研究的重要指標。

當前誘發膽管細胞癌公認的危險因素有膽管結石、寄生蟲感染、膽管炎等,而針對膽管細胞癌的預后的危險因素研究顯示,有淋巴及遠處轉移的患者,其預后明顯差于無轉移的患者〔17〕,腫瘤的分化程度也與預后明顯相關〔18〕。研究發現,HER2在大約15%的浸潤性乳腺癌中過度表達和擴增,是抗HER2藥物反應的分子靶點和預測標記〔19〕。Claudin-18在胰腺癌中陽性表達率>96%,且隨分化程度升高表達顯著升高,在上皮病變中可達98%〔20〕。本研究結果提示,HER2、Claudin-18與膽管細胞癌的發生發展存在密切的關系、也有其他研究報道HER2的過表達與病理分期、浸潤深度、淋巴結轉移和腫瘤大小有關〔21,22〕,有關Claudin-18蛋白的研究顯示,其可參與腫瘤細胞的轉移,并在增殖和分化凋亡過程中發揮了重要作用〔23〕,這與本研究結果相似。但有報道發現,Claudin-18在肺腺癌中的表達與年齡、淋巴結轉移均無關〔24〕,這與本研究結論存在一定差異,可能原因為Claudin-18在不同癌癥中的異質性差異所致,需要進一步研究。

研究表明,HER2與多種腫瘤的預后不良因素有關,其是胃癌、乳腺癌、腸癌等惡性腫瘤的獨立危險因素〔25,26〕,而Claudin-18在進展期胃印戒細胞癌(SRCC)患者中高表達,其在原發性胃癌和進展期胃SRCC中的表達差異有顯著性(77% vs 95.24%),提示以Claudin-18為基礎的靶向治療在進展期胃SRCC的治療中具有很大的潛力〔27〕。本研究結果提示,HER2、Claudin-18表達可影響患者預后生存時間,二者可能在膽管細胞癌患者的預后中發揮作用。這為膽管細胞癌的預防提供重要參考價值,另外通過靈敏度曲線分析顯示,檢測HER2、Claudin-18具有很高的敏感度,對膽管細胞癌早期檢測有指導意義。

綜上,HER2和Claudin-18與肝外膽管細胞癌的發生發展有關,其可能成為其臨床預后的預測指標。