NEAT-1、PD-1、ADAM17在中老年HIV感染患者中表達及其與T淋巴細胞亞群的相關性

桂林 何文林 黃遠帥 涂業桃 田剛

(1西南醫科大學附屬醫院輸血科,四川 瀘州 646000;2瀘州市疾病預防控制中心;3西南醫科大學附屬醫院醫學檢驗部)

現今對于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染中老年患者的治療方式保持與成人治療一致性原則,主要通過選擇不同機制藥物聯合治療進行HIV高效抗逆轉錄病毒治療〔1〕。相比于年輕群體,中老年群體機體各功能均有所退化,T淋巴細胞計數降低,因此更容易遭受病毒侵襲,HIV感染率及死亡率更高〔2〕。Liu等〔3〕研究表明,轉錄本(NEAT)-1在HIV感染靶細胞過程中起重要作用,并且在轉錄后可調控病毒的表達,NEAT-1與HIV感染具有密切聯系。淋巴細胞表面表達的程序性死亡受體(PD)-1通過與其配體PD-1L結合能夠負向調節細胞功能,HIV感染可能通過調節PD-1/PD-1L的表達來影響淋巴細胞的成熟〔4〕。任園園等〔5〕研究顯示,解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)17是新近發現的ADAM蛋白家族的成員,可在大多數組織中表達,并在炎癥、腫瘤生長和血管生成過程中顯著上調,在腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用。但有關ADAM17在HIV感染患者機體中的表達及與病情發展的關系研究甚少。本文旨在探究NEAT-1、PD-1、ADAM17在中老年HIV感染患者中的表達及與T淋巴細胞亞群的相關性,為HIV感染治療提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2019年1月至2020年1月在西南醫科大學附屬醫院就診的67例中老年HIV感染患者作為HIV組,病程(20.29±3.21)個月;感染途徑:同性傳播15例(22.39%)、異性傳播30例(44.78%)、注射毒品17例(25.37%)、其他5例(7.46%);合并糖尿病21例(31.34%)、高血壓19例(28.36%)、高脂血癥27例(40.30%)。選取在醫院進行健康體檢的53例中老年健康體檢者作為對照組進行對比,HIV組年齡50～80歲,對照組年齡50～75歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。本研究經醫院倫理委員會批準,研究患者及家屬均已簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料

1.2納入及排除標準 納入標準:HIV組入組患者符合《中國艾滋病診療指南(2018版)》〔6〕中對HIV感染診斷標準,患者經檢查均為HIV感染癥狀,且對照組均身體健康無不良癥狀。排除標準:合并腎臟嚴重損害者、惡性腫瘤、精神疾病、心臟疾病、心腹功能嚴重異常者、自身免疫系統疾病者、嚴重心血管疾病患者、依從性差及不配合治療者。

1.3NEAT-1、PD-1、ADAM17 mRNA檢測 抽取所有患者清晨空腹靜脈血5 ml,以離心半徑10 cm、轉速1 000 r/min離心處理10 min,在-50 ℃環境下保存。采用熒光定量PCR檢測NEAT-1、PD-1、ADAM17,在細胞轉染24 h后,提取各組細胞總RNA,在測量濃度后,放置在-80 ℃保存,根據逆轉錄盒步驟進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增,反應條件:85 ℃,2 min;85 ℃,20 min;80 ℃,20 s;30個循環,重復實驗3次。引物序列:NEAT-1上游:5′-ACATTTTCCACCTCTGCTTC-3′,下游:5′-TGGCTTCACGTTAGTGACTG-3′;miR-155上游:5′-ACATGTTCCATTCCCCTTTC-3′,下游:5′-CACGTTTATGGCTC TAGTGG-3′;ADAM17上游:5′-ACATCCTCTTCCTTGCATTC-3′,下游:5′-TGAGTTTGCCGTGATCACTG-3′;利用2-△△Ct法計算血清NEAT-1、PD-1、ADAM17 mRNA。

1.4T淋巴細胞亞群檢測 采用抗凝全血標本,在Falcon流式樣管內置入30 μl T淋巴細胞亞群試劑及50 μl全血,充分混合均勻,放置室溫陰暗處20 min后加入10倍稀釋流式細胞技術(FACS)溶血素500 μl,放置室溫陰暗處10 min。應用muleiTEST自動軟件獲取淋巴細胞,并分析T淋巴細胞免疫報表,報告顯示CD4+與CD8+T淋巴細胞成百分率及CD4+/CD8+比值。

1.5病情嚴重程度分級 依據《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》WS293-2019〔7〕,CD4+細胞≥500個/μl為無免疫缺陷,350～499個/μl為輕度免疫缺陷,200～349個/μl為中度免疫缺陷,<200個/μl為重度免疫缺陷。

1.6統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行方差齊性檢驗、獨立樣本t檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1NEAT-1、PD-1、ADAM17水平比較 如表2所示,與對照組相比,HIV組NEAT-1、ADAM17水平均顯著降低,PD-1顯著升高(P<0.05)。

表2 各組NEAT-1、PD-1、ADAM17及T淋巴細胞亞群水平比較

2.2T淋巴細胞亞群水平比較 如表2所示,與對照組相比,HIV組CD4+細胞降低,CD8+細胞升高,CD4+/CD8+細胞比值降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3中老年HIV感染影響因素的多元Logistic回歸分析 如表3所示,以患者發生HIV感染作為因變量(輕度=0,中、重度=1),將NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+細胞作為自變量,納入二分類多因素Logistic回歸分析,結果表明,NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+細胞為影響中老年HIV感染的顯著因素(P<0.05)。

表3 發生中老年HIV感染影響因素的多元Logistic回歸分析

2.4NEAT-1、PD-1、ADAM17與T淋巴細胞亞群之間相關性分析 NEAT-1與CD4+/CD8+比值呈正相關(r=0.022,P=0.004);PD-1與CD4+/CD8+比值之間呈負相關(r=-0.441,P=0.001);ADAM17與CD4+/CD8+比值呈正相關(r=0.362,P=0.001)。

3 討 論

因HIV感染引起的機體免疫功能缺陷臨床無法治愈,可通過藥物治療控制進展,危險性極高〔8〕。根據研究調查,目前全球范圍內HIV患病率與死亡率都逐年增長,其我國表明現存活HIV攜帶者與HIV患者約有85萬例,死亡率累積超過30萬例〔9〕。HIV主要傳播途徑為血液、性接觸傳播及母嬰傳播〔10〕。研究表明,HIV感染機體后,存在細胞因子的飄移現象而隨著病程的發展,細胞因子的表達呈進行性失調對疾病的預后有重要影響〔11〕。本研究表明,NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均與中老年HIV感染及T淋巴細胞亞群相關,可用作于臨床預測中老年HIV感染的預測指標。

在機體免疫系統功能中主要為T淋巴細胞由CD4+、CD8+兩群細胞組成,其CD4+主要為輔助在HIV感染中的主要靶細胞,當人體免疫功能出現缺陷的主要原因為CD4+數量及功能降低從而引起HIV感;CD8+屬于抑制T淋巴細胞,在控制HIV復制過程中起到重要作用;且CD4+/CD8+比值可有效反映中老年HIV疾病狀況,并可作為評價HIV感染者免疫系統損害狀況最重要的指標〔12〕。

NEAT-1是在細胞核內一種被稱為旁斑的結構上,且對旁斑結構的形成及維持具有重要關系,其旁斑主要將持編輯的RNA滯留在細胞核內,因此使基因的表達水平降低〔13〕。根據Peterson等〔14〕研究表明,NEAT-1表達降低可導致病毒的產生,其機制主要是增加HIV-1 mRNA在細胞核到胞質的轉運及出核。張喜等〔15〕研究顯示NEAT-1在發現時主要作用為肺癌的預后指標,其與許多實體腫瘤有所關聯,NEAT-1在細胞核中參與細胞核結構的形成及基因表達過程。隨著深入研究發現NEAT-1與一些病毒感染相關,在腎綜合征出血熱患者的腎組織中高表達〔16〕。本研究發現,NEAT-1在中老年HIV表達量降低,顯示NEAT-1的表達與中老年HIV感染有著相對關聯,并對HIV疾病發展有著重要影響,但機制表達尚不清楚,需進一步研究分析。

共刺激分子在T淋巴細胞成熟過程中發揮了重要作用,B7-H1是近年來新發現的一類免疫抑制性共刺激分子,與相應受體PD-1結合后能夠抑制T淋巴細胞的成熟、削弱T淋巴細胞的免疫應答功能〔17〕。多種病毒感染能夠通過PD-1/PD-1L途徑來負向協同刺激免疫應答,抑制機體免疫系統對病毒的殺傷作用〔18〕。劉婷婷等〔19〕研究認為,PD-1在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T細胞中的表達明顯增多且與CD4+T細胞數目、HIV病毒載量有關。本研究發現,中老年HIV組PD-1水平與對照組相比均上升,并且PD-1為影響中老年HIV感染發生因素,且PD-1與CD4+/CD8+比值之間具有相關性,與以上研究結果一致。

ADAM17屬于一種金屬蛋白酶域的蛋白,其活性的ADAM17主要功能可剪切許多跨膜細胞因子及生長因子的細胞外功能,形成游離的活性形式并激活效應的受體,并在下游信號轉導通路中發揮生物學作用〔20〕。崔博翔等〔21〕研究發現,ADAM17在腫瘤中多數為高表達,主要因α轉化生長因子形成一條分泌信號轉導,其在腫瘤轉移過程中參與重要作用。另外有報道顯示,ADAM17在乳腺癌組織中的表達量與淋巴細胞轉移的數目呈正相關,因此證實ADAM17與乳腺癌的進展有著密切關系〔22〕。本研究結果顯示,中老年HIV感染中ADAM17表達量降低,可表明ADAM17活性異常表達增加HIV感染的惡性趨勢,但有關ADAM17參與HIV感染的機制尚未明確還需進一步深入研究。