鳶尾素通過調控內質網應激抑制脂多糖誘導的THP-1巨噬細胞炎癥反應

符宗冬 李鴿 林雪娟 陳麗君,2 張大啟,2 李其富,2 廖小平 趙文杰

(1海南醫學院第一附屬醫院神經內科,海南 ?？?570102;2海南省熱帶腦科學研究與轉化重點實驗室)

炎癥與許多老年慢性疾病的發生發展密切相關,如動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、糖尿病、帕金森病和阿爾茨海默病等〔1〕,而巨噬細胞及其免疫網絡在慢性炎癥過程中發揮重要作用,深入研究并篩選基于調控巨噬細胞過度活化的分子靶點,對許多慢性疾病的預防與治療有積極意義。鳶尾素(Irisin)作為一種新近發現的糖基化蛋白,已被證實可改善運動并參與糖脂代謝〔2〕。近年研究發現,糖尿病和慢性腎臟疾病患者血清Irisin水平明顯下降,且其水平與炎癥因子水平之間存在相關性〔3〕。此外,Irisin還可明顯減輕脂多糖(LPS)誘導的炎癥〔4〕,然而其分子抗炎機制仍不十分清楚。

本研究通過檢測Irisin對LPS誘導的人髓系白血病單核細胞(THP)-1、巨噬細胞分泌的白介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平、細胞線粒體膜電位(MMP)和活性氧(ROS)水平及其對內質網應激(ERS)和核轉錄因子(NF)-κB信號通路的影響,探索Irisin是否可通過調控ERS改善巨噬細胞炎癥,為其作為分子靶點預防和治療慢性炎癥相關疾病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 人THP-1單核細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。佛波酯購于美國Sigma-Aldrich公司。TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于美國 Invitrogen 公司。LPS、MMP試劑盒(JC-1)和ROS試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。內質網應激信號通路蛋白雙鏈RNA激活的蛋白激酶類內質網激酶(PERK)、激活轉錄因子(ATF)6和肌醇需要酶(IRE)1相關抗體、phospho-NF-κB p65和NF-κB p65抗體均購于美國Cell Signaling Technology,Inc (CST)公司。Irisin購自美國PeproTech公司。衣霉素(TM)購自CST公司。

1.2ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平 采用0.1 μmol/L佛波酯誘導THP-1細胞48 h,使其從單核細胞分化為巨噬細胞。然后,利用無血清培養基培養THP-1巨噬細胞24 h,接著分別用LPS、不同濃度Irisin、LPS+不同濃度Irisin或LPS+Irisin(200 ng/ml)+ TM(10 ng/ml)進行培養。培養24 h后,收集上清。分為正常對照組(不進行任何操作的單一THP-1巨噬細胞)、LPS組(THP-1巨噬細胞炎性模型組,LPS 200 ng/ml)、25 ng/ml Irisin組、50 ng/ml Irisin組、100 ng/ml Irisin組、200 ng/ml Irisin組、LPS+25 ng/ml Irisin組、LPS+50 ng/ml Irisin組、LPS+100 ng/ml Irisin組、LPS+200 ng/ml Irisin組、LPS+200 ng/ml Irisin+10 ng/ml TM組。根據ELISA試劑盒說明書檢測各組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.3MMP檢測 按照JC-1說明書測定MMP。操作如下:將JC-1染色工作液加入每個孔中,孵育45 min。之后,用1×JC-1染色緩沖液清洗細胞兩次,在熒光顯微鏡下觀察,或用熒光酶標儀測量熒光值。

1.4ROS檢測 根據ROS試劑盒說明檢測細胞內ROS水平。將THP-1巨噬細胞與2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37 ℃孵育45 min。使用熒光酶標儀測量熒光值或熒光顯微鏡下觀察。

1.5Western印跡檢測 RIPA緩沖液裂解細胞提取各組蛋白?？偟鞍诐舛扔枚姿?BCA)試劑盒檢測。蛋白質在10%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離,轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。采用5%(W/V)脫脂奶粉封閉2 h,使用抗PEPK、IRE1α、免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP)、NF-κB p65、phospho-NF-κB p65、β-actin和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗4 ℃孵育過夜。二抗孵育2 h。使用Amersham Imager 600QC凝膠成像儀獲得圖像。使用Image J對條帶強度進行半定量分析。

1.6統計學分析 采用PRISM軟件(GraphPad 5.0,San Diego,CA,USA)進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1Irisin和TM對LPS誘導的THP-1巨噬細胞IL-6、IL-1β和TNF-α分泌的影響 與正常對照組相比,LPS可顯著增加THP-1巨噬細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平(均P<0.05);僅有高濃度Irisin(100 ng/ml和200 ng/ml)處理LPS誘導的THP-1巨噬細胞后,可明顯抑制IL-6、IL-1β和TNF-α濃度(P<0.05);單獨使用Irisin處理THP-1細胞后IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平組間差異無統計學意義(P>0.05)?？紤]到Irisin濃度為200 ng/ml時,IL-6、IL-1β和TNF-α的水平下降最多,所以選擇200 ng/ml Irisin作為后續實驗的最佳濃度,設為LPS+Irisin組。與LPS+200 ng/ml Irisin組相比,LPS+200 ng/ml Irisin+TM組THP-1巨噬細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 Irisin和TM對LPS誘導的THP-1巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的影響(pg/ml,n=3)

2.2Irisin對LPS誘導的THP-1細胞MMP的影響 與正常對照組相比,LPS組紅綠熒光強度明顯降低(P<0.05)。而與LPS組相比,LPS+Irisin組紅綠熒光強度比值明顯升高(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 各組THP1巨噬細胞MMP和氧化應激比較(×200)

表2 各組THP-1巨噬細胞氧化應激和MMP比較

2.3Irisin對LPS誘導的THP-1細胞ROS的影響 與正常對照組相比,LPS組細胞ROS顯著增加(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+Irisin組ROS含量下降到正常水平,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2和圖1。

2.4Irisin對LPS誘導的THP-1巨噬細胞BIP、PERK、IRE1和phospho-NF-κB p65表達的影響 LPS組BIP、PERK和IRE1α表達水平明顯高于正常對照組(均P<0.05);LPS+Irisin組BIP、PERK和IRE1α的表達水平明顯低于LPS組(均P<0.05);與LPS+Irisin組相比,LPS+Irisin+TM組BIP、PERK和IRE1α表達明顯增加(均P<0.05)。進一步發現,與正常對照組相比,LPS組的phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯增加(P<0.05);LPS+Irisin組中phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯低于LPS組(P<0.05);與LPS+Irisin組相比,LPS+Irisin+TM組中phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯增加(P<0.05)。見表3、圖2。

1～4:正常對照組、LPS組、LPS+Irisin組、LPS+Irisin+TM組

表3 各組內質網應激及NF-κB關鍵蛋白相對表達水平比較

3 討 論

Irisin于2012年由Bostr?m等〔2〕首次發現,是一種運動誘導的、骨骼肌分泌的糖基化蛋白,前期研究發現其具有改善運動、參與糖脂代謝、保護線粒體和神經元等功能。后續發現Irisin在動脈粥樣硬化、糖尿病、腦卒中、肥胖、炎癥性腸病和阿爾茨海默病等疾病中發揮明顯抑炎作用〔5〕。巨噬細胞在許多慢性炎性相關疾病致病機制中起關鍵作用。LPS是革蘭陰性菌外膜的重要組成部分,是巨噬細胞的主要炎癥刺激因子。LPS通過激活許多信號通路,觸發人類單核細胞和巨噬細胞產生的某些細胞因子,包括TNF-α和IL-1家族,誘發炎癥反應,在各種炎癥性疾病的進展中發揮重要作用。LPS誘導的THP-1巨噬細胞是研究炎癥的一個經典細胞模型〔6,7〕。為了探索Irisin的可能抑炎機制,本研究采用了LPS誘導的THP-1巨噬細胞體外模型,結果支持Irisin在慢性炎癥過程中發揮抗炎作用。

線粒體功能障礙導致能量代謝異常,產生過多的ROS,在引起誘發炎癥方面起重要作用〔8〕。本研究發現,Irisin可以改善LPS誘導的氧化應激損傷。這些結果表明,Irisin可能通過改善線粒體功能和氧化應激,在減少巨噬細胞炎癥細胞因子的分泌發揮關鍵作用。通過這種機制,Irisin可以維持機體巨噬細胞內的氧化還原平衡,從而發揮抑炎作用。

ERS是一種保護性的細胞應激反應,多表現為內質網平衡的破壞和各種病理狀態下的功能障礙。長期或過度的ERS可能會引起炎癥反應或細胞凋亡,在激活巨噬細胞誘導的炎癥反應中起重要作用,并參與各種慢性炎性相關性疾病的發展〔9〕。它可導致大量錯誤折疊和未折疊的蛋白質在內質網腔內積聚,并引起鈣平衡的紊亂。未折疊蛋白反應(UPR)途徑是ERS中最重要的通路,它可通過分子伴侶葡萄糖調節蛋白(GRP)78/BIP和3種受體蛋白激活,即PERK、ATF6和IRE1 3條信號通路激活炎癥反應〔10,11〕。此外,氧化還原平衡失調和線粒體功能障礙在ERS介導的炎癥反應中也起著重要作用。本研究發現Irisin可以抑制ERS的過度激活,而且這種作用被ERS激活劑TM所逆轉。在正常生理條件下,PERK和IRE1在維持ERS方面起關鍵作用,而在病理條件下,它們通過與BIP解離而被激活,引起一系列的UPR。UPR通過 PERK、 IRE1、 ATF6 三條信號通路激活炎癥反應,進一步激活NF-κB信號通路〔12〕。NF-κB的經典活性形式由 p50/p65 復合物組成,可以形成不同于 rel、激活蛋白(AP)1和類固醇激素受體家族成員的二聚體。NF-κB被認為是炎癥過程和自身免疫性疾病的一個重要機制〔13〕。許多重要的抗炎和免疫抑制藥物都抑制NF-κB通路,因此本研究檢測了NF-κB通路相關蛋白的表達水平,結果發現Irisin可明顯抑制NF-κB p65的激活,提示Irisin可能通過阻止ERS和NF-κB通路的激活,從而減少炎癥因子的分泌。

綜上,Irisin可有效抑制LPS誘導的THP1巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌,改善線粒體功能,維持細胞內的氧化還原平衡。其可能機制是通過抑制ERS和NF-κB信號通路,從而在某些慢性炎癥相關疾病中產生抗炎作用,因而Irisin未來有希望成為治療許多老年慢性炎癥相關疾病的潛在藥物靶點。